植物精油对柑橘的保鲜效果

潘小军,陈媛,江和栋

(江西中医药大学 药学院,江西 南昌,330004)

柑橘营养价值高,种植面积大。根据国际粮农组织(International Food and Agriculture Organization,FAO)显示,中国柑橘类水果的种植面积约占全世界的1/3,年产量大于100万t[1]。柑橘内含有丰富的糖分与水分,腐烂率通常在10%～30%[2],造成的经济损失非常大,研究柑橘保鲜技术对降低釆后损失具有重要意义。在中国的柑橘贮藏中,常用具有抑菌或杀菌作用的化学药物、涂蜡、浸泡保鲜剂、包裹保鲜袋等方法来防止由机械损伤而带来的霉菌感染,这些传统的保鲜方法对于消费者安全食用果蔬和高效摄入营养物质而言,依然存在较大差距[3]。因此寻找安全高效、低毒、低残留的保鲜剂已成为一种趋势。天然资源植物精油慢慢地成为柑橘贮藏中病害防治的有效方式[4]。

植物精油是从草本植物的花、树皮、种子和果实中萃取得到的芳香物质,分子小,挥发性高,是一种难溶于水的油状液体。据已有报道,多种植物内含有酚类、类黄酮素和抗毒素等物质,这些物质有一定的抗菌活性。赵恭文等[5]发现植物提取液对某些植物病原真菌有较强的抑菌作用,并分析这些药用植物活性成分很可能在植物精油中。精油这类天然物质具有安全环保、低毒低残留、不易产生抗药性等特点,常用于鲜切水果、果蔬保鲜以及作物腐败菌和致病菌的控制,但某些精油本身的特性会对果蔬的感官评价产生影响。为解决此问题,在食品保鲜时最好用涂层保鲜配方[6]。柑橘贮藏期间,果实pH通常在2.2～4.0,呈酸性,多数果实的腐烂由真菌引起[7],其中主要的病菌是意大利青霉和指状青霉[8],在釆后保鲜和运输过程中,造成的损失约为柑橘类水果总损失的90%[9]。目前很多研究表明,植物精油对多种作物腐败菌和致病菌有明显抑制作用,但很多试验只针对单一或少数几种植物精油进行研究,且效果不一。

本试验研究预选的13种植物精油对柑橘主要致病菌意大利青霉(Penicilliumitalicum)和指状青霉(Penicilliumdigitatum)的抑制作用,并测得强抑制作用精油的最低抑菌浓度(minimal inhibit concentration,MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC),对柑橘进行打孔贮藏试验,探究其实际的保鲜效果,为植物精油用于柑橘的贮藏保鲜提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

市售“纽荷尔”脐橙,选取大小均匀、无机械损伤、无病虫害、成熟度一致的脐橙进行试验；意大利青霉(PenicilliumitalicumGDMCC 3.489)、指状青霉(PenicilliumdigitatumGDMCC 3.490),广东省微生物菌种保藏中心；丁香、牛至、桂皮、八角、鼠尾草、百里香、迷迭香、柠檬桉,肉豆蔻、广藿香、生姜、雪松以及甘草精油,美国诺奥(Now Foods)公司；马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基,青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；无水乙醇,AR,天津市永大化学试剂有限公司；吐温80,CP,国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

YP电子天平,上海律平科学仪器有限公司；DW-9微生物试剂分液器,杭州大微生物技术有限公司；立式压力蒸汽灭菌器、GR-240型热空气消毒箱、HHS-21-6型电热恒温水浴锅,上海博迅实业有限公司医疗设备；JP-100B型超声波清洗机、BCD-275TMBC型冰箱,青海海尔股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 十三种植物精油抑菌圈的测定

(1)菌悬液的制备：活化后的供试菌被接种到PDA平板培养基上,放于25 ℃恒温培养箱培养1周；用无菌蒸馏水将培养菌边过滤边洗入试管中,采用2倍稀释法将供试病原菌稀释至孢子浓度为108CFU/mL。

(2)滤纸圆片的制备：用直径为6 mm的打孔器于约3 mm厚的纸板打孔,获取的滤纸圆片放于玻璃培养皿湿热灭菌,放于干燥箱24 h,无菌条件保存,备用。

(3)制作含菌平板：菌悬液吸取1 mL于提前准备好的PDA平皿培养基涂抹均匀,将在植物精油原液中充分浸泡(30 s)后沥干的滤纸圆片放入上述已含意大利青霉、指状青霉的平皿中,25 ℃培养72 h,观察菌的生长情况。试验重复3次,最后结果取其平均值。

(4)抑菌圈直径的测量：用十字交叉法量取平皿抑菌圈直径,平均直径=(最大抑菌圈直径-滤纸片直径)/2

1.3.2 MIC和MBC的测定

根据抑菌圈试验选取上述几种强效植物精油,2倍稀释法将PDA培养基配制成最终质量分数分别为0.012 5%、0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%的含植物精油的培养基,同时设置对照(不含植物精油)。用平板涂布的方法,用无菌接种环将菌液在已经凝固且混合均匀的精油的PDA培养基中划一条菌液线。重复试验3次,置于25 ℃培养箱中培养72 h,待对照组培养皿中菌丝体充分生长后,与对照相比,观察植物精油各浓度对菌的抑制效果,无菌生长的最低浓度即为MIC。将无菌生长的培养皿继续培养至7 d后观察,以无菌生长的最低浓度即为MBC。

1.3.3 菌丝生长抑制试验

参考杨红等[10]用固体稀释法设置0.006 3%～0.40% 7个浓度梯度的分别含丁香、牛至、桂皮的PDA培养基,无菌水做空白对照,倒入平板冷凝。用6 mm打孔器取菌块,将菌块放入含植物精油的培养基中央,各浓度重复2次试验,置于26 ℃恒温培养箱,培养24 h后将平皿倒置,待空白对照的菌丝长满培养皿后开始测量。运用十字交叉法测量各平皿菌落直径,计算各组试验结果的平均值,抑菌率计算如公式(1)所示：

(1)

1.3.4 柑橘打孔贮藏试验

参照孙思明[11]的方法,用2倍稀释法,设置0.012 5%～1% 7个浓度的丁香、牛至、桂皮处理液,选用无病害的果实,于200 mg/L的NaClO溶液浸泡10 min,再用流水清洗,晾干。将直径为5 mm的打孔器于柑橘表面刺一个小孔,加入25 μL不同浓度的处理液,对照分别加入等量蒸馏水和吐温80作为普通对照和吐温对照,最后加入菌液15 μL,用保鲜袋包装置于25 ℃条件下贮藏,于贮藏第4天用十字交叉法测得其菌孔大小,腐烂面积计算如公式(2)所示：

(2)

式中：∑πr2,创伤口面积总和,cm2;n,创伤口总数;r,创伤口的腐烂半径,cm。

1.3.5 数据处理与分析

采用 Excel 2010 进行数据处理和作图,采用SPSS 19.0中 Duncan 新复极差法进行差异显著性分析,显著性水平设置P<0.05。

2 结果与分析

2.1 十三种植物精油对意大利青霉和指状青霉的抑菌效果

不同植物源精油,对意大利青霉和指状青霉的抑菌效果也有显著的差别。各植物精油对供试菌的抑菌圈大小如表1所示。在13种植物精油中桂皮精油对意大利青霉和指状青霉的抑菌效果最佳,其抑菌圈直径分别为43.11、39.03 mm；其次是牛至和丁香精油,其对意大利青霉抑菌直径分别为39.32、35.81 mm,对指状青霉抑菌直径分别为27.89、21.50 mm。八角、鼠尾草和迷迭香精油均对意大利青霉和指状青霉具有抑制效果,但显著低于桂皮、牛至和丁香精油(P<0.05),百里香精油具有与桂皮、牛至和丁香精油同等的抑菌作用。柠檬胺精油仅对指状青霉菌起抑制作用,肉豆蔻仅对意大利青霉菌有抑制作用,而广藿香、生姜和雪松、甘草精油等对2种供试菌均无抑菌作用。如表2所示,桂皮对意大利青霉和指状青霉的MIC和MBC值均较小,浓度都为0.012 5%；牛至精油对意大利青霉的MIC和MBC值均为0.05%,对指状青霉的MIC和 MBC值均0.1%；而丁香精油对意大利青霉的MIC和 MBC值分别为0.05%、0.1%,对指状青霉的MIC和 MBC值分别为0.1%、0.2%。另外3种精油对2种菌的MIC和 MBC值均大于0.4%。在已有报道中,桂皮和丁香精油的主要成分肉桂醛和丁香酚对意大利青霉菌有较好的抑制效果[12]。牛至精油的主要成分酚类化合物有较强的天然抗菌作用[13],因为百里香精油含有和牛至精油同样的成分百里香酚,所以百里香精油对意大利青霉和指状青霉的抑菌效果表现较好。吴克刚等[14]发现牛至和百里香组合表现出明显的协同效果,SOHYUN等[15]研究发现肉桂皮,牛至和百里香组合也有协同抗菌活性。董路路等[16]也表明对青霉菌的抑菌效果从大到小依次为牛至精油、肉桂精油和丁香精油。

表1 植物精油对供试菌的抑菌作用Table 1 Antibacterial effect of plant essential oils on tested bacterias

表2 植物精油对供试菌的MIC、MBC 单位：%

2.2 丁香、牛至和桂皮精油对菌丝生长抑制效果

由图1可知,在设置的7个浓度中,牛至、桂皮和丁香精油对意大利青霉菌的抑制作用普遍强于对指状青霉的抑制作用。这3种精油对意大利青霉菌和指状青霉菌在浓度≥0.1%时,抑菌率达到100%。0.01%的牛至精油对意大利青霉和指状青霉的抑菌率分别为95.4%和73.0%；当浓度升高至0.03%,牛至精油对意大利青霉和指状青霉的抑菌率分别为100%、90.3%。0.01%的桂皮精油对意大利青霉和指状青霉的抑菌率分别为47.0%、14.4%；浓度为0.03%时,对2种菌的抑菌率分别为64.8%、31.6%；浓度为0.05%时,抑菌率分别为90.9%、75.8%。0.01%的丁香精油对意大利青霉和指状青霉的抑菌率分别为53.4%、44.9%；浓度为0.03%时,对2种菌的抑菌率分别为97.0%、76.6%；浓度为0.05%时,抑菌率分别为100%、90.4%。有学者[17-19]认为丁香对青霉菌抑菌效果好,抑菌谱较宽。蒋志国等[20]也认为丁香抑菌效果好于肉桂,除了对青霉菌有较好的抑菌作用外,丁香精油还能激发宿主防御反应,抑制丙二醛(malonaldehyde,MDA)积累,有效地控制由青霉菌而引发的柑橘类水果蓝霉病的发病率[21]。

2.3 柑橘打孔贮藏

牛至、桂皮和丁香精油对意大利青霉接种柑橘在打孔贮藏第4天时的腐烂面积见图2。与对照组相比,采用精油处理能抑制柑橘的腐烂,其腐烂面积均显著低于对照组(P<0.05)。精油浓度在0.012 5%时,各处理组的小孔周围均出现了腐烂,腐烂面积最大的是牛至(1.04 cm2),其次是丁香(0.71 cm2)、桂皮(0.36 cm2),3种精油处理效果存在显著性差异(P<0.05)。浓度在0.025%～0.2%时,丁香和牛至样品的处理孔径未发生变化(5 mm),无腐烂现象。桂皮精油在浓度0.2%以上时,丁香、牛至精油在浓度分别为0.25%、0.5%以上时,出现了不同程度的腐烂(P<0.05)。ELCOCKS等[22]的研究表明肉桂皮精油在浓度>0.5%的情况下,会在≤6 min发挥杀菌活性,作用时间延长会影响处理样品的品质。造成这种现象的原因可能是外源处理物引起角质层的变化[23],高浓度的桂皮精油对柑橘果实果皮角质层造成的破坏更严重,导致果皮角质层本身的防止水分流失和抵御微生物侵害等功能丧失,而且张静等[24]证明角质基质的含量减少,指状青霉的菌丝生长或者是孢子的萌发会被促进。

a-牛至;b-桂皮;c-丁香图1 牛至、桂皮和丁香精油对意大利青霉和指状青霉的抑菌率Fig.1 Inhibition rate of oregano,cinnamon and clove ssential oil against Penicillium italicum and Penicillium digitatum 注：不同字母表示处理间差异显著(P<0.05),大写字母表示的是意大利青霉,小写字母表示的是指状青霉

图2 植物精油对柑橘贮藏过程中腐烂面积的影响Fig.2 Effect of plant essential oils on rotten area of citrus during storage 注：不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)

在贮藏期间,指状青霉组普通对照第4天的腐烂面积高达10.19 cm2,第6天为29.96 cm2。桂皮处理的指状青霉组的腐烂面积高于其他处理组,这与杨文侠等[25]在实际贮藏中发现肉桂提取液导致脐橙失重率和腐烂率升高的现象一致,但具体原因不详。如图3-b,意大利青霉+牛至精油处理组的腐烂面积最小,但牛至精油的味道较重,致使处理样品的品质较其他组稍差,目前胶囊包埋技术的应用可以降低该精油对食品品质的破坏[26],有学者[27-29]应用植物精油制作保鲜纸或涂膜瓦楞纸箱实现对水果的保鲜。在同样的贮藏时间内,指状青霉组的腐烂面积以及菌丝的生长速率显著大于意大利青霉组,这与丁仁慧等[30]的试验贮藏效果相似。指状青霉的处理腐烂情况如图3-c,在其打孔部位及菌孔周围3～4 mm处未出现明显的菌丝,且菌丝主要生长部位是柑橘最先变软的组织。

a-指状青霉(上-处理组；下-对照组);b-意大利青霉;c-指状青霉图3 牛至处理样品Fig.3 Oregano treatment samples

3 结论

结果表明,在打孔保鲜贮藏期间,指状青霉菌和意大利青霉菌会破坏柑橘品质导致腐烂加剧。牛至、桂皮、丁香、百里香、鼠尾草和迷迭香等精油对供试菌有抑制作用,其中抑制作用最强的是桂皮,其次是牛至和丁香。0.1%的牛至、桂皮和丁香精油处理可有效抑制青霉菌在果实上的生长,经过该浓度处理的柑橘的腐烂速度明显降低,可以延长柑橘的贮藏时间。

植物精油成分复杂,不同植物精油内可能有相同作用成分,同种植物通过不同提取方式所得到的精油作用强度也有差异。目前对于植物精油成分之间的相互作用的研究,植物精油对于多种菌的共同作用效果的研究较少。在现研究中,植物精油的潜在植物毒性以及强烈的感官特性的研究还不够深入,所以植物精油保鲜的商业实施存在一定的局限性。但人们依旧渴望天然物资资源的利用,植物精油较其他防腐保鲜试剂还是更加有优势,值得更加深入的研究。