普氏原羚致病性大肠杆菌的分离及生物学鉴定

李秀萍，王世辰，简莹娜，林伟山，王光华，胡勇，罗涛，何玉邦，赵殿智，梁钦，李成林，马利青

(1.青海大学畜牧兽医科学院，西宁810016;2.青海湖国家级自然保护区管理局，西宁810001;3.青海省刚察县林草站，刚察812399)

普氏原羚(Procapra przewalski)是一种极度濒危的羚羊，也是中国特有的物种，被IUCN红色名录列为濒危(EN)等级，是国家一级保护动物。1875年，俄罗斯探险家普热瓦尔斯基首次在内蒙古鄂尔多斯采得本种的模式标本，普氏原羚也因此得名。历史上，普氏原羚曾分布于内蒙古、甘肃、宁夏和青海的广大地区。

20世纪60年代，普氏原羚曾是青海湖地区一种常见动物，而1994年在青海湖周边地区仅发现约300只左右［1］。1999年被列入《中国濒危动物红皮书》，在2017年的IUCN红皮书中被列为濒危(EN)物种(IUCN/SSC，2017)。青海省林业局和中科院西北高原生物研究所对普氏原羚调查表明，普氏原羚现存7个相互隔离的种群，分别是元者、湖东、海晏刚察、塔勒旋果、鸟岛、生格和切吉滩［2］。

据青海湖巡湖员讲述，每年在巡湖过程中都会发现一些死亡的普氏原羚尸体。为确诊本次普氏原羚幼龄羊死亡的原因，进行了相关病原诊断及病原菌生物学特性分析试验，具体试验如下。

1 发病情况

2021年9月18日，刚察县哈尔盖镇某牧民发现1只普氏原羚幼龄公羊不合群，精神沉郁，随后卧地不起，最后死亡，遂反映给保护站，由保护站送检至青海大学畜牧兽医科学院兽医生物技术研究室进行病原诊断。

2 剖检变化

心脏肿大，心包积液;肝脏有2个豌豆大小的钙化结节灶;脾脏正常;肺脏气肿，左侧肺小叶尖部背侧有4×4mm大小的淤血斑块;肾脏未见异常;肠淋肿大;小肠鼓气，肠壁变薄，内充满黄色稀便;结肠肠壁增厚，有出血点;回盲口有溃疡。

3 分离培养

无菌采集病死普氏原羚的心、肝、脾、肺、肾、肠淋、胃肠内容物等接种至普通肉汤、鲜血平板和VF培养基中，37℃培养24h。脾脏培养物中，普通营养肉汤变浑浊，表面有菌膜;鲜血平板上有灰色、中等大小、具有β溶血的圆形菌落。将可疑菌落接种于麦康凯和伊红美蓝培养基中，经37℃培养24h后，在麦康凯培养基上可见玫红色菌落，在伊红美蓝培养基上为黑色带金属光泽菌落。

4 小鼠致死性试验

经鲜血平板纯化的分离菌株接种至普通肉汤，分别取18h普通肉汤培养物0.2 mL和0.5 mL，经腹腔注射昆明系实验小鼠各3只，对照组2只注射相应剂量的营养肉汤，结果0.5 mL剂量组的3只小鼠在注射后12h内死亡;0.2 mL剂量组的2只小鼠在24h内死亡;对照组未出现异常。将致死小鼠的脾脏再次培养后，分离到相同形态的细菌。

5 生化试验

从细菌微量生化鉴定管中选取用于鉴定肠杆菌科的生化鉴定管(葡萄糖、乳糖、甘露醇、MR-VP、靛基质均购自杭州微生物试剂有限公司)，将分离菌分别接种至生化鉴定管中，置37℃温箱培养24h，分离菌株能发酵葡萄糖、乳糖;甘露醇产酸产气;MR试验阳性;VP试验和靛基质试验阴性，符合大肠杆菌的特性(表1)。

表1 普氏原羚肺脏分离菌株生化试验结果

6 分子生物学检测

对该菌进行分离、纯化培养后，利用细菌16S rRNA特异性引物进行PCR扩增(见图1)，扩增产物送样测序，经序列比对分析表明，分离菌株为大肠杆菌。

图1 分离菌16S rRNA基因扩增结果

7 药物敏感性试验

药物敏感性试验表明，该菌株对磺胺甲恶唑(SXT25)、诺氟沙星(NOR10)、氯霉素(C30)和环丙沙星(CIP5)高度敏感;对强力霉素(DO30)、四环素(TE30)、卡那霉素(K30)中等敏感;对呋喃妥因(P10)、杆菌肽(B10)和多黏霉素(CT10)耐药(详见表2)。

表2 分离菌株药物敏感性试验

8 小结

经临床症状，剖检变化，病原菌的分离培养，生化发酵试验，致病性试验，PCR及测序分子鉴定，药物敏感试验，表明该普氏原羚幼龄羊是感染了致病性大肠杆菌死亡，且该菌株具有一定耐药性。

9 讨论

近年来，随着普氏原羚种群保护力度的加大，其种群数量有所增加，但仍然没有达到人们期望的理想数量。普氏原羚的死亡原因较多，狼是原羚的主要天敌，能造成15%～20%的死亡，网围栏挂伤死亡比例占5%，报道称原羚采食垃圾后导致消化不良而死亡现象较多［3］。也有学者认为体内外寄生虫病也是死亡的原因之一［4-6］。霍宾等［7］(2020)认为原羚的死亡与机体严重缺硒有一定的关联。李忠秋［8］(2016)认为与普氏原羚的性别、群体类型、群体大小、捕食风险、人类干扰等有关。董逵才［9］(2016)认为环湖地区的草场围栏和硬化渠道等人工设施是影响普氏原羚生存和发展的主要因素。本次试验结果表明，牛、羊跟普氏原羚共享一个草场，使得家养动物跟野生动物之间可能存在动物疫病的相互传播。

本次实验室检测虽分离得到了致病性大肠杆菌，但并没有进行病原菌的动物溯源调查，从药物敏感性试验的结果来看，分离菌株已经产生一定耐药性，间接说明分离菌株有可能感染自放牧家畜或栖息环境中，因为正常情况下野生动物是不会接触到相关抗菌素的。

同时，本研究室在另外的研究中进行过致病性大肠杆菌的动物溯源调查［10］，随着野生动物病原分离培养的积累，在今后的研究中将会开展类似的动物病原溯源调查，以此来为控制野生动物和家养动物感染大肠杆菌相关疾病提供技术依据。

致谢在样品采集过程中得到青海湖国家级自然保护区管理局和刚察县林草站的大力支持，在此一并致谢。