IDO1和IL-10在喉鳞状细胞癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系研究*

彭丽娜，武川军，冯志星，赵倩

（邯郸市中心医院 耳鼻喉科，河北 邯郸056001）

原发性喉癌以喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC）最为常见，患者以声嘶、咳嗽、呼吸困难为主要临床表现，早期确诊并根据个体化病情采取合理的治疗方案是提升患者5年生存率的最可靠方式[1-2]。肿瘤细胞迅速增殖、侵袭、迁移等是导致患者生存时间短、预后不良的重要因素，故寻找肿瘤恶性演进过程中扮演重要角色的分子是后续靶向治疗的基础，对早期明确肿瘤恶性程度及治疗方案的选择具有重要意义。吲哚胺2，3-双加氧酶1（indoleamine 2, 3-dioxygenase 1, IDO1）是肝外色氨酸沿犬尿氨酸途径分解代谢过程中的一种限速酶，已被证实在宫颈癌[3]、食管癌[4]等恶性肿瘤组织中呈异常高表达，并且参与肿瘤细胞的增殖、迁移等过程，与患者的不良预后密切相关。 白细胞介素-10（Interleukin-10, IL-10）是肿瘤发生过程中重要的免疫抑制因子，IL-10 在甲状腺癌[5]、胰腺癌[5]等肿瘤中高表达，参与肿瘤细胞周期调控、免疫逃逸、迁移等过程，与肿瘤的恶性程度和不良预后相关。目前关于IDO1、IL-10 在喉鳞状细胞癌组织中的表达及其对疾病预后的影响研究不多，本次研究以此为切入点展开分析，旨在明确检测IDO1、IL-10 表达在LSCC 病情评估、预后判断中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年7月—2017年7月邯郸市中心医院进行喉部肿瘤切除术治疗且术中病理确诊为LSCC 的患者89 例作为研究对象。其中，男性48例，女性41 例；年龄32～78 岁，平均（59.38±8.21）岁；体质量指数（BMI）为21～27 kg/m2，平均（24.03±2.17）kg/m2。术中留取患者的LSCC 组织及癌旁组织标本各89 份。本研究经医院医学伦理委员会审核批准，患者签署知情同意书。

1.2 纳入和排除标准

纳入标准：①符合LSCC 诊断，首次确诊并接受治疗、既往无相关病史；②根治性手术前无放化疗等保守治疗；③合并喉部严重感染性疾病；④年龄18～80 岁。排除标准：①复发性喉癌、喉腺癌；②合并其他原发恶性肿瘤疾病；③妊娠或者哺乳期女性；④拒绝接受随访者。

1.3 免疫组织化学法检测标本组织中IDO1、IL-10 表达

所有标本组织均离体后2 h 内放入4%甲醛中固定24 h，石蜡包埋，常规病理苏木精-伊红染色。常规石蜡切片，每张切片厚4 μm。免疫组织化学法检测标本组织中IDO1、IL-10 的表达。免疫组织化学试剂盒购自上海西唐生物科技公司，具体操作按试剂盒说明书步骤进行。一抗为鼠抗人单克隆抗体（浓度1∶30），每次染色均使用PBS 作为一抗的阴性对照。在高倍显微镜下观察可见，LSCC组织细胞中IDO1、IL-10 分别定位于胞质、胞核，呈浅黄色及棕褐色颗粒染色。单个标本随机选取10 个视野。染色面积计分标准如下：无着色为0分，＜25%着色为1 分，25%～50% 着色为2 分，＞50%着色为3 分；染色强度计分标准如下：不显色为0 分，浅棕黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。表达阳性情况以染色面积积分+染色强度积分进行判断，设0分为“-”，1～2分为“+”，3～4 分为“++”，5～6 分为“+++”。将“+”“++”“+++”均判定为阳性。

1.4 随访

采用门诊或住院复查、电话回访等方式进行随访，随访终点为2019年9月1日或者患者死亡时间点，记录平均生存时间。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以例（%）表示，比较用χ2检验；绘制Kaplan-Meier 生存曲线，比较用Log rank χ2检验；采用Cox 多因素风险回归模型分析预后的影响因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LSCC 组织与癌旁组织中IDO1 和IL-10 表达阳性率的比较

LSCC 组织中IDO1 表达阳性率与癌旁组织比较，差异有统计学意义（P＜0.05），LSCC 组织高于癌旁组织；LSCC 组织中IL-10 表达阳性率与癌旁组织比较，差异有统计学意义（P＜0.05），LSCC 组织高于癌旁组织。见表1 和图1。

图1 LSCC组织及其癌旁组织中IDO1、IL-10表达 （HTC×400）

表1 LSCC组织与癌旁组织中IDO1和IL-10表达阳性率的比较 [n=89，例（%）]

2.2 不同临床病理特征LSCC 患者IDO1 和IL-10表达阳性率的比较

不同TNM 分期、分化程度、淋巴结转移、远处转移的LSCC 患者IDO1、IL-10 表达阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同性别、年龄、肿瘤位置的LSCC 患者IDO1、IL-10表达阳性率，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 不同临床病理特征LSCC患者IDO1和IL-10表达阳性率的比较 例（%）

2.3 IDO1 和IL-10 表达与预后的关系

绘制Kaplan-Meier 生存曲线并进行Log rank χ2检验，与IDO1、IL-10 阴性患者比较，IDO1、IL-10阳性患者的总生存时间明显缩短（P＜0.05）。截至到随访时间，IDO1 阳性组的术后总生存率为35.09%（20/57）、术后中位生存时间为24 个月，IDO1 阴性组的术后总生存率为46.88%（15/32）、术后中位生存时间为35 个月。两组比较，差异均有统计学意义（χ2=6.015，P=0.014）。IL-10 阳性组的术后总生存率为32.81%（21/64）、术后中位生存时间为27 个月，IL-10 阴性组的术后总生存率为48.00%（12/25）、术后中位生存时间为33 个月。两组比较，差异均有统计学意义（χ2=5.164，P=0.023）。见图2。

图2 IDO1、IL-10阳性表达与IDO1、IL-10阴性表达患者的生存曲线

2.4 LSCC患者预后的影响因素分析

建立Cox 比例风险回归模型，以TNM 分期、分化程度、淋巴结转移、远处转移、IDO1、IL-10为自变量，以预后状况为因变量，赋值1=死亡，0=生存，t=生存期，其他各变量赋值见表3。采用逐步后退法，以进行自变量的选择和剔除，设定α入=0.05，α出=0.10。Cox 回归结果显示，TNM 分期较高[=1.351（95% CI：1.055，1.730）]、分化程度较低[=0.734（95% CI：0.562，0.959）]、淋巴结转移[=1.448（95%CI：1.095，1.915）]、远处转移[=1.246（95%CI：1.035，1.500）]、IDO1 阳性表达[=1.575（95% CI：1.156，2.146）]、IL-10 阳性表达[=1.771（95% CI：1.250，2.508）]是LSCC 患者预后的 影响因素（P＜0.05）。见表3。

表3 LSCC患者预后影响因素的Cox多因素风险回归模型参数

3 讨论

LSCC 恶性程度较高，早期易出现侵袭、转移，严重威胁患者生命安全[7]。有研究指出免疫逃逸在LSCC 发生、发展中发挥重要作用，故明确对机体免疫功能产生关键性影响作用的分子可能对日后的治疗具有重要意义[8]。IDO1异常高表达可促使细胞中色氨酸耗竭，使多种细胞失去正常功能，并且抑制免疫细胞增殖，对机体正常抗肿瘤免疫功能产生负面影响[9-10]。IL-10 也是一种重要的免疫抑制因子，通过促进Th2 细胞增殖、抑制Th1 细胞增殖、抑制APC抗原递呈功能，最终影响细胞毒性T淋巴细胞对肿瘤的识别[11-13]。关于IDO1、IL-10 在LSCC 组织中的表达已有初步报道[14-15]，但关于上述分子对LSCC 病情及预后的影响研究涉及不多。鉴于这一现状，本研究以LSCC 组织中IDO1、IL-10 的表达为切入点，发现LSCC 组织中IDO1、IL-10 的阳性表达率高于癌旁组织，这一结果说明IDO1、IL-10的异常高表达参与了LSCC的发生、发展。

临床病理特征可从不同方面客观反映患者病情严重程度，故衡量蛋白表达情况与病理特征的相关性可间接说明该蛋白对病情严重程度的影响[16-17]。文中根据肿瘤组织中IDO1、IL-10的表达阳性与否对入组患者进行二次分组，通过比较其性别、年龄、肿瘤位置、TNM分期、分化程度、淋巴结转移、远处转移等因素后发现：TNM分期高、分化程度低、合并淋巴结转移及远处转移的患者IDO1、IL-10 阳性表达率更高，说明高表达的IDO1、IL-10 是LSCC 恶性程度高的重要标志，与既往研究所述IDO1、IL-10在肿瘤进展中发挥的作用吻合。IDO1、IL-10表达增加后可对机体免疫系统造成不同程度抑制，促使肿瘤细胞发生免疫逃逸，并加速病情进展，这可能是高表达IDO1、IL-10的LSCC患者病理特征不理想的核心原因之一。

本研究对入组患者进行术后长期随访并发现，IDO1、IL-10 阳性表达者生存时间较短，说明IDO1、IL-10 高表达对LSCC 患者的远期生存具有负面作用。使用Cox 多因素风险回归模型探讨对LSCC 患者生存时间产生直接影响的因素，发现较高的TNM 分期、较低的分化程度、淋巴结转移、远处转移、IDO1 阳性表达、IL-10阳性表达均是缩短患者生存时间的危险因素。该结果推测与IDO1、IL-10 高表达后促进LSCC 病情进展相关。IDO1、IL-10 表达阳性与LSCC恶性程度以及患者的不良预后相关，提示可以将IDO1、IL-10 应用到LSCC 的临床诊断和预后评估当中，并且早期联合检测有助于预测LSCC 的预后风险，从而为临床制订针对性干预方案提供参考。

综上所述，LSCC 组织中IDO1、IL-10 表达阳性率较癌旁组织异常升高，且阳性表达患者的TNM 肿瘤分期较高、分化程度较低、合并淋巴结转移及远处转移的比例较高，同时是导致患者远期生存时间缩短的危险因素之一。IDO1、IL-10表达可能是影响LSCC 发生、发展的重要分子之一，干扰其表达对疾病病情及预后的影响研究有望在日后进一步展开。