8株奶牛乳房炎链球菌的分离鉴定与耐药性分析

王 慧，刘伯承，杨 俊，杜丽飞,2，彭苗苗,2，刘俊琦，王红兵

（1.湖南省畜牧兽医研究所，湖南长沙410131；2.湖南鑫广安农牧股份有限公司，湖南长沙410129）

乳房炎是造成奶牛业损失最多的全球性奶牛疾病，常导致牛奶产量和质量下降。引起奶牛乳房炎的因素复杂多样，其中病原菌感染尤为普遍，目前报道的已有80余种，其中链球菌是引起奶牛乳房炎最主要的病原菌之一。以无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和化脓链球菌等最为常见[1]。据报道，链球菌所致的奶牛乳房炎临床症状不明显，容易被忽视，从而造成不必要的经济损失。同时，随着抗生素的普遍使用甚至滥用，造成药物治疗无效。因此，定期进行病原菌的分离鉴定及耐药分析极其重要。实验研究了奶牛隐性乳房炎中链球菌的分布及耐药性，为该牛场在治疗奶牛乳房炎时选择药物及后期的防控工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基：普通营养肉汤培养基（自配）、绵阳血琼脂平皿（购自长沙市宝生盾生物科技有限公司）；

1.1.2 实 验 试 剂：药 敏 纸 片、mark2000、PCR Master Mix、GelRed核酸染料、电泳液、琼脂糖，细菌基因组DNA提取试剂盒，均购自长沙市宝生盾生物科技有限公司；16s RNA通用引物，由华大基因合成。

1.1.3 病料来源：试验所用菌株来自湖南地区某奶牛场，采集疑似隐性乳房炎的患牛乳汁并分离到的8株链球菌。

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳房炎判断标准：牛乳体细胞数（SCC）推荐分级标准参照国际乳业联合会（IDF）的规定，其中SCC＜50万个/mL为健康奶牛；100万个/mL＞SCC＞50万个/mL为隐性乳房炎；SCC＞100万个/mL为临床型乳房炎[2]。

1.2.2 链球菌的分离纯化：将送检乳样无菌接种于绵羊血琼脂平板，37℃培养18～24 h，观察是否有菌落生长并挑取可疑单个菌落进行传代纯化，纯化后再将单个菌落接种于普通肉汤培养基中，于37℃振荡培养18～24 h，获得纯菌株增菌液。

1.2.3 链球菌的PCR测序鉴定：对所纯化细菌用16s RNA（27F/1492R）通用引物进行扩增,序列为：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，扩增片段长度为1500bp左右。挑取纯培养后的细菌于灭菌纯水中混匀，于100℃水浴10分钟，再置于冰块10分钟以上，然后离心取上清液即为病原菌的基因组作为PCR模板，进行基因片段的扩增，并用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，进行基因测序后Blast比对。

1.2.4 链球菌的药物敏感性试验：采用K-B纸片扩散法，对分离出的主要病原菌进行药敏试验，按照CLSI推荐的肉汤稀释法及标准[3]判断其耐药性。选用的药物有氨苄西林、头孢拉定、阿奇霉素、庆大霉素、四环素、万古霉素、链霉素、恩诺沙星。

1.2.5 链球菌耐药基因检测：取1.5ML增菌液，按照细菌基因组DNA提取试剂盒步骤提取细菌DNA，-20℃保存备用。耐药基因引物序列及扩增条件参考文献[4]，共检测了10种链球菌耐药基因（大环内酯类：ermA；ermB；mefA；氨基糖苷类：Aph3’；四环素类：tetL；tetK；tetM；tetO；喹诺酮类：gyrA；ParC）。以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增。

2 实验结果

2.1 链球菌的分离鉴定结果

于2020年接收该牛场的5次送样共计52份样品中分离出8株链球菌，编号为：1、5、7、13-1、6-2、4-2、20、23，基因测序鉴定显示乳房链球菌4株（5、7、6-2、4-2）、停乳链球菌2株（20、23）、A群链球菌2株（1、13-1）。

2.2 药敏试验结果

试验结果显示，本次分离到的8株链球菌整体耐药率不高，每株细菌均能筛选出3种以上的敏感药物。从整体上看对链霉素、庆大霉素、诺氟沙星耐药率最高，链霉素耐药率100%；庆大霉素耐药率87.5%，诺氟沙星耐药率62.5%；对氨苄西林、头孢拉定、万古霉素耐耐药率为0，对阿奇霉素、四环素耐药率为37.5。具体结果见表1。

表1 链球菌的药敏试验结果 （抑菌圈：mm）

2.3 耐药基因检测结果

对分离的8株链球菌10种耐药基因检测显示，大环内酯类ermB基因和喹诺酮类的gyrA和ParC检出率最高，其次是四环素类tetL，tetK基因；氨基糖苷类mefA，其他4种耐药基因均未检出。其中编号为13-1和6-2的A群链球菌携带耐药基因最多，其次为编号20、23的停乳链球菌和编号1的乳房链球菌。携带耐药基因最少的是编号为5、7、4-2的乳房链球菌。

表2 8株链球菌的耐药情况统计

3 讨论

本次试验主要分离到乳房链球菌、停乳链球菌和A群链球菌，乳房链球菌分离率最高，并没有分离到无乳链球菌，说明该场的常在乳房炎病原菌为乳房链球菌，与国内的其他报道无相关性[5-7]，说明奶牛乳房炎病原微生物复杂多样，不同牛场分离菌株存在差异性，并不能参照其他报道进行预防与治疗，所以检测本场常在病原菌种类，明确病原菌的耐药性显得极其重要。

抗生素等抗菌药仍是兽用抗炎药物的主要选择，在治疗疾病方面起着重要的作用，无论是人类还是动物，甚至植物在预防和治疗各种细菌性感染疾病均离不开抗生素，然而对抗生素的过度依赖，加上滥用，对生命已经造成了一些不可逆转的危害。据统计，我国每年抗生素总产量大约为21万吨，国内消费量约18万吨，其中用于畜牧及饲料行业的抗生素就高达9.7万吨，约占54%[8]，由于抗生素的大量使用，我国已成为全世界耐药性最严重的国家。在奶牛乳房炎的防治过程中大量依赖抗生素，也不同程度增加了细菌耐药性，某些抗菌药物几乎没有作用，给奶牛乳房炎的治疗加大了难度。本试验中分离的8株细菌均有不同程度的耐药，其中对链霉素已经100%耐药，庆大霉素和阿奇霉素的耐药率也分别达87.5%和62.5%。因此建议该场需减少这几类抗生素的使用，而选择敏感性强的氨苄西林、头孢拉定或者万古霉素等相应类抗生素。

在对8株链球菌进行耐药基因检测时发现，8株链球菌均不同程度的携带有耐药基因，其中A群链球菌携带耐药基因最多，其次是停乳链球菌和乳房链球菌。共计检测出6种不同类型的耐药基因，分别为gyrA（87.5%）、ParC（75.0%）、ermB（75.0%）、tetL（25.0%）、tetK（12.5%）、mefA（12.5%）。可以看出本次分离出的链球菌携带喹诺酮类耐药基因gyrA（87.5%）最高，其次是喹诺酮类耐药基因ParC（75.0%）和大环内酯类耐药基因ermB（75.0%），氨基糖苷类耐药基因Aph3’并未检出，这与药敏试验结果并没有很高的符合率，药敏试验中分离链球菌对氨基糖苷类的庆大霉素和链霉素均有较强的抗药性，也可能是携带了其他氨基糖苷类的耐药基因所致。而喹诺酮类的耐药基因除了编号4-1未检出外，其他菌株均有携带，但对诺氟沙星的抗药性却为达到100%。说明细菌耐药性的产生是一个非常复杂的过程，耐药基因的检测只能作为其中一环参考因素来考虑。

目前在治疗奶牛乳房炎方面仍未研究出能完全替代抗生素的药物，抗生素仍是治疗奶牛乳房炎的首要选择，因此如何合理的选则抗菌药、完善抗菌药的使用策略来减少细菌耐药性德产生是临床上亟待解决的问题，最简单的方式就是药敏试验来筛选该养殖场常在致病菌的敏感药物，避免过度使用无效抗生素。同时加大细菌耐药机制的研究，以期减少耐药菌的产生。 □