川黄柏中原小檗碱型生物碱及其细胞毒性研究*

闫玉鑫， 杨颖， 池利昆， 郑萍

(云南师范大学 职业技术教育学院，云南 昆明 650092)

川黄柏(PhellodendronchinenseSchneid.)又名川黄檗或黄皮树等，是芸香科(Rutaceae)黄柏属(Phellodendron)植物，其干燥树皮作为中药黄柏的基源植物收载于《中国药典》2020年版一部.川黄柏味苦，性寒，归肾和膀胱经，具有清热燥湿、解毒疗疮和泻火除蒸的功效，主治湿热泻痢、黄疸尿赤、带下阴痒和热淋涩痛等.川黄柏中主要含有生物碱类、酚酸类和黄酮类等化学成分[1-3].其中生物碱是黄柏主要成分，含量高达3%以上，主要包括盐酸小檗碱、药根碱、巴马汀和掌叶防己碱等原小檗碱型四氢异喹啉类生物碱.本课题组前期对川黄柏干燥茎进行了系统的化学成分研究，分离得到包含小檗碱在内的7个化合物[4].本研究对前期分离得到的大量成分小檗碱多次重结晶后，发现其母液的硅胶TLC板有多个生物碱样品点，进一步分离后得到4个成分(1-4)，对二氢小檗碱(1)的核磁共振(NMR)谱进行详细归属，对hediamine(2)的构型用X单晶衍射证实.采用人肝癌细胞(HepG2)对所得化合物进行细胞毒性筛选，化合物1 对HepG2生长的抑制作用较强，IC50值为0.18 μmol/L.

1 仪器与材料

1.1 药材

川黄柏购买于陕西省西安市药材市场，经中国科学院昆明植物研究所李锡文教授鉴定为芸香科黄柏属植物川黄柏(PhellodendronchinenseSchneid.)的茎.

1.2 仪器

紫外光谱由日本Shimadzu公司生产的UV-2600测定；红外光谱由日本Shimadzu公司生产的IR-450测定；质谱由英国Micromass公司生产的VG Autospec-3000质谱仪测定；NMR谱由Bruker AV-400和DRX-500核磁共振仪测定，四甲基硅烷(TMS)为内标.96孔培养板、酶联免疫检测仪和二氧化碳培养箱为法国Thermo-Napco公司产品.

1.3 材料

柱色谱用硅胶为青岛海洋化工厂产品(48～75 μm)；碱性氧化铝为上海盛亚化工有限公司产品(38～48 μm)；反相硅胶为Merk公司生产的Lichroprep RP-18(40～63 μm)；Sephadex LH-20为Pharmacia公司产品；薄层色谱材料为青岛海洋化工厂生产的GF254硅胶高效板；生物碱显色剂为自配的改良碘化铋钾试剂.3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)为德国sigma-aldrich公司产品；二甲基亚砜(DMSO)为国药集团化学试剂有限公司产品，顺铂(DDP)为昆明贵研药业有限公司产品，批号：20191102；人肝癌细胞(HepG2)来自昆明理工大学衰老与肿瘤分子遗传学实验室.

2 提取和分离

干燥的川黄柏茎粉碎成粉末(30.0 kg)经95%甲醇加热回流提取3次(3×50 L，8 h)，合并提取液，浓缩，加0.01 mol/L盐酸水溶液5 000 mL稀释，分别用乙酸乙酯萃取三次，得到非生物碱部分.酸水液用2%氢氧化钠碱化至pH=10，用氯仿萃取三次得到生物碱部分(280 g).氯仿萃取部分反复上硅胶柱层析、SephadexLH-20和RP-18硅胶柱层析得到小檗碱(18 g)，再经多次甲醇溶液重结晶，其母液显示多个样品点.母液经硅胶柱色谱分离，最后用石油醚-乙酸乙酯(体积比25∶1)、SephadexLH-20和碱性氧化铝反复柱层析得到化合物1(12 mg)、2(13 mg)、3和4(7 mg)，其中化合物3和4为白色羽状结晶，是两个化合物的混晶.

3 结构鉴定

化合物1：无色结晶，改良碘化铋钾显橘红色.EI-MSm/z：338[M+H]+，分子式C20H20NO4；1H-NMR(CDCl3，500MHz)δ：6.61(s，H-1)，7.17(s，H-4)，3.34，2.74(m，H-5)，3.85，3.70(m，H-6)，6.87(d，J=8.5，H-11)，6.97(d，J=8.5，H-12)，6.10(s，H-13)，5.67(s，H-14)，5.94(s，O-CH2-O)，3.87(s，OCH3)，3.94(s，OCH3).13C-NMR(CDCl3，500MHz)：108.1(t，C-1)，146.3(t，C-2)，147.4(d，C-3)，104.1(s，C-4)，128.7(d，C-4a)，30.4(t，C-5)，51.5(t，C-6)，137.5(d，C-8)，114.8(s，C-8a)，149.6(s，C-9)，146.7(t，C-10)，118.6(t，C-11)，114.4(s，C-12)，129.2(s，C-12a)，97.4(t，C-13)，73.4(d，C-14)，124.9(d，C-14a)，101.0(t，O-CH2-O)，61.0(q，OCH3)，56.2(q，OCH3).在HMBC谱中H-14(δH5.67)与C-5(δC30.4)、C-8(δC137.5)、C-8a(δC114.8)和C-12a(δC129.2)相关；H-6(δH3.85，3.70)与C-14(δC73.4)相关；H-5(δH3.34，2.74)与C-6、C-1(δC108.1)和C-4a(δC128.7)相关.综合以上光谱数据与已知化合物pachycanthine数据比较[5]，鉴定化合物1为pachycanthine，即二氢小檗碱.

化合物2：无色结晶，改良碘化铋钾显橘红色.EI-MSm/z：366[M+H]+，分子式C21H20NO5；1H-NMR(CDCl3，500MHz)δ：6.43(s，H-1)，6.74(s，H-4)，1.63(m，H-5)，2.84(m，H-6)，6.46(d，J=2.0 H-9)，7.39(dd，J=8.0,2.0，H-11)，6.49(d,J=8.0，H-12)，3.90(6H，s，OCH3).13C-NMR(CDCl3，500MHz)：113.0(d，C-1)，145.7(s，C-2)，149.8(s，C-3)，117.3(d，C-4)，133.5(s，C-4a)，26.4(t，C-5)，46.4(t，C-6)，166.0(s，C-8)，124.5(d，C-9)，125.2(s，C-9a)，156.3(s，C-10)，122.7(d，C-12)，133.5(d，C-13)，130.1(s，C-13a)，123.6(d，C-14)，136.5(s，C-15a)，56.6(q，OCH3).综合以上光谱数据与已知化合物hediamine数据比较[6]，鉴定化合物2为hediamine，对其X-单晶衍射分析进一步确定其绝对构型.

化合物3：无色结晶，改良碘化铋钾显橘红色.EI-MSm/z：298[M+H]+，分子式C18H20NO3；1H-NMR(CDCl3，500MHz)δ：6.40(s，H-1)，6.74(s，H-4)，6.62(d，J=2.5 H-9)，7.09(dd，J=8.2,2.5，H-11)，6.64(d，J=8.2，H-12)，3.76(s，OCH3)，2.23(s，NCH3).13C-NMR(CDCl3，500MHz)：106.9(d，C-1)，145.4(s，C-2)，148.9(s，C-3)，116.5(d，C-4)，131.4(s，C-4a)，24.8(t，C-5)，45.6(t，C-6)，165.7(s，C-8)，122.3(s，C-8a)，122.8(d，C-9)，151.6(s，C-10)，121.5(d，C-11)，131.4(d，C-12)，129.8(s，C-12a)，36.9(t，C-13)，62.8(d，C-14)，134.6(s，C-14a)，56.3(q，OCH3)，42.6(q，NCH3).综合以上光谱数据与已知化合物2-methoxy-berbin-10-ol数据比较[7]，鉴定化合物3为2-methoxy-berbin-10-ol.

图1 pachycanthine的HMBC谱

图2 hediamine的单晶结构(碳编号为随意编号)

化合物4：无色结晶，改良碘化铋钾显橘红色.EI-MSm/z：298[M+H]+，分子式C18H20NO3；1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：6.43(s，H-1)，6.74(s，H-4)，6.46(d，J=2.0 H-9)，7.39(dd，J=8.0,2.0，H-11)，6.49(d,J=8.0，H-12)，3.90(s，OCH3)，2.55(s，NCH3).13C-NMR(CDCl3，500MHz)：113.0(d，C-1)，145.7(s，C-2)，149.8(s，C-3)，117.3(d，C-4)，133.5(s，C-4a)，26.4(t，C-5)，46.4(t，C-6)，166.0(s，C-8)，125.2(s，C-8a)，124.5(d，C-9)，156.3(s，C-10)，122.7(d，C-11)，133.5(d，C-12)，130.1(s，C-12a)，38.9(t，C-13)，64.9(d，C-14)，136.5(s，C-14a)，56.6(q，OCH3)，43.1(q，NCH3).综合以上光谱数据与已知化合物3-methoxy-berbin-10-ol数据比较[7]，鉴定化合物4为3-methoxy-berbin-10-ol.

4 体外抗肿瘤活性检测

取处于对数生长期的人肝癌细胞调整到一定的细胞浓度后加入96孔培养板，每孔90 μL.待培养24 h细胞贴壁后加入受试样品.样品设 0.01、0.1、1、10 μg/mL和100 μg/mL 5个受试浓度，每个浓度设3个平行孔，每孔10 μL.阴性对照为等体积生理盐水.溶媒对照为对应于10 μg/mL和100 μg/mL 两个高浓度样品的DMSO，分别为0.02%和0.2%.阳性对照为10 μg/mL等体积的DDP.加药后在37℃、5% CO2培养箱中培养72 h后，加入MTT(5 mg/mL)，每孔 20 μL，培养4 h，再加入三联液(10% SDS-5%异丁醇-0.012 mol/L HCl(w/v/v))溶解，每孔100 μL，继续培养12～20 h，用酶标仪在570 nm单波长下测定各孔的OD值.计算样品不同浓度的OD值均数，按下列公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率=(OD对照孔-OD受试孔)/OD对照孔× 100%，采用LOGIT法计算半数抑制浓度IC50.化合物1、2和3与4混合物对人肝癌细胞的生物活性十分明显，IC50值分别为0.18、3.49 μmol/L和 6.15 μmol/L.

5 讨论

小檗碱是从多种植物中分离得到的具有广谱抗菌和体外抗肿瘤作用的生物碱，川黄柏主产于我国南方各省，为提取小檗碱的原料之一.本试验对川黄柏茎的化学成分进行研究，运用多种分离纯化技术和鉴定技术，从小檗碱粗提物中发现4个小檗碱类型生物碱，对其核磁数据进行了准确归属，并研究其对人肝癌细胞的生物活性.进一步证明了小檗碱类化合物具有显著细胞毒性，为合理开发利用该类成分奠定了理论基础.