香蕉内生贝莱斯芽孢杆菌YX-11的分离鉴定与功能研究

李万芹,何鹏飞,吴毅歆,何鹏搏,Shahzad Munir,孔宝华,李兴玉,何月秋

(云南农业大学,云南 昆明 650201)

香蕉是世界上生产最多的一种水果,为全球4亿人口的主食[1]；香蕉的生产和种植面积也在逐年增加[2]。气候变化将会推动香蕉种植范围的扩大,估计到2070年,适合香蕉种植的面积将会增加50%[3]。然而全球香蕉生产受尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense, Foc)引起的枯萎病严重威胁。为了防治该病害,人们大量施用化学农药,但后者对环境以及安全方面的负面影响一直引起人们担忧与对生物防控的关注和兴趣[4]。

内生菌是指对宿主植物无明显伤害,在生命周期或某一阶段于植株里生活的一类微生物[5]。一些内生菌表现出植物促生特性以及良好的植物病原拮抗效果,从而得到了应用[6-7]。然而,尽管科学家们期望通过努力能采用生物防治的办法有效地控制香蕉枯萎病,但至今生物防治商品真正能得到大量应用的事例比化学农药少得多[8]。因此,筛选有效防控香蕉枯萎病的生防菌株仍然具有重大意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料

巴西蕉(MusaAAA, cv.Baxi)来自云南省红河州经作站。培养基包括LB培养基、PDA培养基、Ashby无氮培养基、Pikovskaya培养基和解钾培养基,分别用于细菌、真菌分离培养,内生菌的固氮、溶磷和解钾能力的测定。所用病原菌包括尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种Fusariumoxysporumf.sp.cubenserace 4, FOC4、玉米穗腐病菌Fusariumgraminearum、烟草疫霉菌Phytophthoraparasitica、小麦雪腐病菌Typhulaincarnata、玉米顶腐病菌KlebsiellapneumoniaeKpC4、烟草赤星病菌Alterariaalternata、玉米小斑病菌Bipolarismaydis、草莓灰霉病Botrytiscinerea、石榴干腐病菌Coniellagranati、三七黑斑病菌Alternariapanax,它们都为本实验分离和保存的菌株。

1.2 实验方法

1.2.1 香蕉内生菌的分离 从云南省香蕉产地采集香蕉叶片,称取叶片1 g,用清水冲洗干净，然后置于75%酒精中30 s及20%次氯酸钠中4 min，做表面消毒,再用无菌水漂洗5次,将最后一次漂洗液涂板作对照，以检测消毒是否彻底。将消毒后的香蕉叶片用无菌滤纸吸干表面水分后转入无菌研钵中,加入9 mL无菌水研磨至匀浆状,得到浓度为10-1的母液；按10倍梯度将母液依次稀释成浓度为10-2、10-3、10-4的稀释液；取不同浓度的稀释液200 μL涂布于LB培养基,重复3次,在28 ℃下培养3～7 d。

1.2.2 内生菌的纯化 用肉眼观察分离出的菌落,挑取形态各异的菌落于相应的培养基上，划线纯化得到单菌落；用无菌牙签挑取单菌落，接入液体LB中，在37 ℃、160 r/min条件下振摇培养2～4 d;然后按1∶1的体积比加入40%的无菌甘油,混合均匀后保存于-80 ℃，备用。

1.2.3 拮抗内生菌的初筛 以FOC4为靶标菌，将其接种于PDA平板上,在28 ℃下倒扣培养3～5 d。待其菌落长出后,使用直径为5 mm的无菌打孔器从菌落边缘打取菌饼,用无菌接种针将菌饼转接至PDA平板中央。用无菌牙签挑取内生菌株的单菌落,点接于距离菌饼中心2.5 cm处,每皿接种4株内生菌,以只接种病原菌为对照。在28 ℃下倒扣培养5 d,观察抑菌圈大小。将初筛有抑菌效果的菌株纳入复筛。

1.2.4 拮抗内生菌的复筛 将每株内生细菌点接4个PDA平板,以未接生防菌的PDA平板为对照,重复复筛试验3次。定期取出观察有无抑菌圈,在7 d后,用十字交叉法测定病原真菌菌落的直径；将按照上述方法得到的抑菌效果较好的若干株内生细菌传代5次以上，持续观察其对香蕉枯萎病的抑菌效果,按如下公式计算出香蕉内生菌对FOC4的抑制率：抑制率(%)=(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100。

1.2.5 生理生化特性的鉴定 参照东秀珠等[9]的方法进行内生菌生理生化特性的鉴定,以解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2(下称Y2)为阳性对照。

1.2.6 分子鉴定 分离获得的内生菌株经反复纯化后,参考Cheng等[10]的方法提取细菌的基因组DNA。利用细菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR反应。PCR体系为20 μL,其中灭菌ddH2O 13.7 μL,10× EasyTaq buffer(+Mg2+)2.0 μL,dNTPs 1.6 μL,1 mmol/L上下游引物各1.0 μL,EasyTaq DNA聚合酶 0.2 μL(1 U),基因组DNA模板0.5 μL(50 ng)。PCR扩增程序:94 ℃预变性4.5 min;94 ℃变性30 s,52 ℃退火40 s,72 ℃延伸1.5 min,共30个循环;72 ℃延伸10 min；于16 ℃保存。将PCR产物送至昆明硕擎生物公司测序。将测得的序列在GenBank 数据库中做BLAST分析,鉴定内生菌的种属。

1.2.7 溶磷、解钾及固氮活性的测定 用无菌牙签蘸取内生细菌，分别点接于无氮Ashby、PVK溶磷或解钾固体平板上,置于28 ℃恒温箱中倒扣培养7 d,观察菌落周围是否有水解圈出现；选择有水解圈的菌落，测量菌落直径d和水解圈直径D,计算出比值D/d,选择比值较大的菌株反复验证其功能活性。

1.2.8 内生细菌的抑菌作用测定 参照1.2.4部分,将已鉴定的内生菌与10种病原真菌做对峙培养,并测定其抑制作用。

1.2.9 内生细菌对盆栽香蕉植株促生作用的测定 对内生菌YX-11与其他几株内生菌做盆栽试验,测定各菌株促进香蕉生长的效果,以浇清水和稀释同样倍数的LB为对照,每组6株,每株为1个重复。将内生菌发酵液稀释成107CFU/mL,单次每盆灌施200 mL,每周1次,处理4次,30 d后测量株高、茎粗、叶宽、叶长等指标。

1.2.10 拮抗菌株的田间防效验证 将无菌香蕉组培苗移栽到育苗盆里,每周用拮抗菌株YX-11按107CFU/mL的菌量喷施1次；在移到大田的前1 d,再以同样的菌量喷施,使育苗盆完全湿润。在移栽时,再浇定根水400 mL左右。同时,每株施用5 kg生物有机肥做底肥。试验设施用生物有机肥、施用有机肥(无YX-11)、不施有机肥三个施肥条件。在生长期间,每月喷淋107CFU/mL的YX-11菌液1次。在香蕉收获前,调查发病株率。

1.2.11 数据分析 试验数据使用SPSS 22软件进行处理,差异显著性分析利用Duncan氏新复极差法进行。

2 结果与分析

2.1 内生菌YX-11的分离

采用稀释法和平板拮抗试验,分离获得抑制香蕉枯萎病菌能力强的菌株,经过初筛、复筛，最终确认1株来自云南省云县巴西蕉叶片的菌株,被命名为YX-11。

2.2 YX-11菌株的鉴定

2.2.1 形态特征 将菌株YX-11在LB培养基平板上置于37 ℃下培养24 h,菌落乳白色、不透明,表面粗糙无光泽,边缘不规则形,有的呈锯齿状,中间有火山口状小突起,表面干燥呈现褶皱,质地易被挑起(图1A)。菌体短杆状(图1B),产芽孢,呈椭圆形(图1C)。

A:菌落。B:菌体。C:芽孢。

2.2.2 生理生化特征 采用生理生化试验鉴定了菌株YX-11和Y2的12个生理生化特征,这些特征在两个菌株间无差异。它们的革兰氏染色、芽孢染色、淀粉水解、V-P反应、明胶液化、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、葡萄糖利用均呈阳性,KOH反应、甲基红试验、丙二酸利用为阴性,不产生吲哚(表1),YX-11被初步鉴定为与Y2同属的芽孢杆菌。

表1 菌株YX-11的生理生化特征鉴定结果

2.2.3 分子鉴定 将YX-11的16S rDNA序列与NCBI数据库进行BLAST比对,选取同源性较高的菌株的序列,利用MEGA 7.0软件采用邻接法构建系统发育树,结果(图2)表明,YX-11菌株与BacillusvelezensisEB14(CP065473.1)聚在一支。依据形态特征、生化指标和分子聚类分析结果,YX-11属于贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis。

图2 菌株YX-11的16S rDNA序列的系统发育树

2.3 YX-11的溶磷、解钾和固氮能力

将YX-11接种在Ashby无氮培养基、Pikovskaya培养基和解钾培养基上,以Y2作为标准对照,以同为香蕉内生菌的I-2和M-1为同类来源菌株对照,结果表明YX-11能够在相应的培养基上生长,具有一定的溶磷、解钾、固氮能力(表2),但它的能力低于3个对照菌株的能力。

表2 菌株YX-11的溶磷、解钾、固氮能力测定结果

2.4 YX-11对病原真菌的抑菌活性

YX-11菌株对香蕉枯萎病等10种病原真菌皆有较好的抑制作用,其中对烟草疫霉的抑制率最高,达72.77%；对香蕉枯萎病菌的抑制率次之，为71.30%；对烟草赤星、石榴干腐病菌、小麦雪腐病菌、草莓灰霉病菌的抑制率分别为72.19%、67.00%、66.11%、64.44%;对玉米穗腐病菌、玉米顶腐病菌、玉米小斑病菌、三七黑斑病菌的抑制率分别为63.33%、58.52%、68.80%和47.00%。结果表明该菌株有广谱的抑菌作用(表3、图3)。

表3 YX-11菌株抑制植物病原真菌的效果

上排为对峙试验,下排为对照。a:烟草赤星病菌。b:烟草疫霉病菌。c:香蕉枯萎病菌。

2.5 YX-11对香蕉植株的促生长作用

以清水和同样稀释倍数的LB培养基为对照,以香蕉内生菌I-2为阳性对照,每次每株灌施YX-11的107CFU/mL悬浮液200 mL,每周1次,连续4次。在30 d后进行测量，结果(表4)表明,YX-11对香蕉的茎粗、株高有显著的促进作用,其中茎粗较LB对照增粗近1倍,较清水对照增加2倍多；YX-11处理的株高亦显著地高于两个空白对照,高于香蕉内生菌I-2,但差异未达显著水平；YX-11处理的叶长、叶宽与各对照差异不显著,叶片数与LB处理有显著差异,显著地多于清水对照及I-2处理。总体来说,菌株YX-11对香蕉盆栽苗有较好的促生长效果,具有用于制备生物功能有机肥的潜力。

表4 不同内生菌促进香蕉生长的效果

2.6 YX-11菌株在田间的应用效果

本田间试验设置施用生物有机肥、施用有机肥、施用无机肥三种施肥条件，在每种施肥条件下又设喷施和不喷施YX-11菌液两种处理。对于前一种处理，在生长期间每月喷淋YX-11的107CFU/mL菌液1次。在收获前,调查各小区的发病株率。以传统苗、不施有机肥和不喷施生防菌的处理为对照,计算各处理防治香蕉枯萎病的效果。结果(表5)表明,施用有机肥处理的发病株率明显地低于施用无机肥的；施用有机肥配合每月喷施1次YX-11,对带菌苗香蕉枯萎病的防效达57.78%，而在相同条件下施用无机肥的防效仅有42.22%。在移栽时,配合施用带YX-11的生物有机肥5 kg/株,种植带菌苗,配合每月喷施1次YX-11,防效可达75.56%,极显著地高于其他处理。不用带菌苗,而是直接使用传统香蕉苗,施用生物有机肥,配合每月喷施1次YX-11,对香蕉枯萎病的防效亦达到68.89%。当每月不喷施YX-11时,仅用带菌苗和施用生物有机肥,则防病效果劣于每月喷施1次YX-11的处理,仅有55.56%。当仅用传统香蕉苗时,由于生物有机肥中的YX-11可以进入香蕉植株体内,因此即使在生长期间不喷施YX-11,施用生物有机肥对香蕉枯萎病的防效也达48.89%。值得特别指出的是,即使不喷施YX-11,不施用生物有机肥和常规有机肥,仅用带菌苗也能减轻枯萎病的发生程度,防效达22.22%。综上所述,施用有机肥可以减轻香蕉枯萎病,施用生物有机肥的防效更好,特别是与带YX-11菌苗结合使用效果最好。每月喷施YX-11,防治枯萎病的效果达20%左右。

表5 不同处理对大田香蕉枯萎病的生物防控效果(发病株率) %

3 讨论

所有植物都携带大量不同类型的有益或中性的微生物,后者栖息于植物内部而没有引起寄主的不良反应[11]。由于有益内生菌能通过一系列不同机制(如植物激素合成、固氮、溶磷、防卫应答诱导以及通过减少乙烯水平减轻非生物胁迫等)促进植物对环境的适应性和生长[12],它们拥有农业应用潜力,但目前仍未被完全地解析清楚[13]。已有源于香蕉植株的内生细菌和真菌作为防御香蕉枯萎病和其他生物限制因子的报道[14]。健康的植株与健康的土壤有着更高的微生物多样性和更为丰富的有益微生物,而这些微生物能改善营养吸收、促进植株生长以及防控土传病害[15-19]。在本研究中,通过广泛地分离云南省各地香蕉内生菌,通过综合评价,获得了YX-11菌株,通过形态学、生物化学和16S rDNA片段分析，鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌。该菌具有解磷、固氮和解钾能力,能抑制多种植物病原真菌,特别是对烟草疫霉有很好的抑制作用,而对疫霉等卵菌病害的生防非常困难。YX-11菌株是否能用于其他植株的卵菌病防控有待进一步研究确认。本研究发现，喷淋、追喷YX-11或者将其制作成生物有机肥后加以应用，对田间香蕉枯萎病均有一定的防治效果,且使用的方式越多,其防治效果越好,如使用带菌苗、生物有机肥和在香蕉生长期间追喷YX-11处理的防效达75.56%,不追喷的防效仅为55.56%,因此,要取得很好的防病效果,必须多次补施该菌株。这种多次施用才能取得更好的防效，可能与香蕉枯萎病菌可以通过风雨、灌溉及农事操作传播,病原菌基数大,香蕉生长周期长,在香蕉植株内定殖的YX-11数量不足以抑制过多的病菌有关。本研究将内生菌YX-11与有机肥结合使用,明显提高了防病效果,这可能与有机肥为YX-11和其他有益微生物提供了营养物质,增加了它们的种群数量有关,也可能与有机肥为香蕉提供了较全面的营养,提高了其抗病性有关。但YX-11在田间有机肥中的适宜比例及在植株内的定殖量等还有待进一步研究。