4,4’-二氨基二苯基甲烷对浮萍(Lemna minor L.)毒性作用

柳燕贞，罗凤娟，梁燕珍，梅承芳，曾国驱,*

1. 广东省科学院微生物研究所，广东省微生物分析检测中心，广州 510070 2. 华南应用微生物国家重点实验室，广州 510070 3. 广东省菌种保藏与应用重点实验室，广州 510070 4. 广东省微生物应用新技术公共实验室，广州 510070

4,4’-二氨基二苯基甲烷(4,4’-methylenedianiline, MDA；CAS-No. 101-77-9)是一种重要的化工中间体，是合成聚氨基甲酸酯、二异氰酸酯和还氧树脂硬化剂等的重要原料。近年来，MDA的使用范围正在扩大，年产量逐年增加，达400万t·a-1[1]。MDA是欧盟REACH法规中的高关注物质之一，其对生态环境及人类健康的潜在危害越来越受到重视[2-4]。当释放到环境中时，MDA首先分配到水体中，使地表水受到污染，随后再分配到沉积物和土壤隔室中。我们的前期实验和他人的研究结果表明，MDA并不具有生物蓄积性，但土壤孔隙中的MDA能够迅速吸附在植物根部表面，从而对水生生物产生毒害作用[5-6]。

浮萍(LemnaminorL.)属于浮萍科，广泛分布于各种水体中，能够灵敏地反映水体污染状况。利用浮萍的生物学特性将其应用于生态环境修复，取得了显著的成果[7-9]。然而有关MDA对浮萍的毒性作用尚未见报道。本研究以浮萍(LemnaminorL.)作为受试生物，通过检测不同浓度的MDA对浮萍生长、叶绿素含量、光合活性、质膜透性和抗氧化酶活性等的影响，初步探讨MDA对浮萍的毒性作用，以期为MDA的水生态风险评估提供理论依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 仪器与试剂

仪器：高效液相色谱仪(Agilent 1260，美国)，电子天平(XS205DU型，梅特勒-托利多公司，瑞士)，紫外可见分光光度计(T6型，北京普析通用仪器有限责任公司，中国)，多用途台式高速离心机(Primo R，Thermo Fisher Scientific，美国)，人工气候箱(PQX-450B-22H，宁波莱福科技有限公司，中国)，手提式pH测试仪(pH 3210，WTW公司，德国)，温湿度记录仪(DSR系列，杭州佐格通讯设备有限公司，中国)，植物效率分析仪(Handy PEA，Hansatech Instrument Ltd.，英国)，便携式多量程电导仪(HI 8733，HACH公司，美国)。

试剂：4,4’-二氨基二苯基甲烷为分析纯，购自美国Sigma公司。其他试剂均为国产分析纯，购自中国广州化学试剂厂。

1.2 受试生物

本次试验选择浮萍(LemnaminorL.)为受试生物。试验植株从广州珠江获得，采集自野外，采集地无明显污染。试验开始前植株已在试验用培养基中培养8周以上。试验开始前7 d，从贮备培养的浮萍中选择足量的浮萍转入新鲜无菌Swedish Standard (SIS)培养基中，并在试验条件下培养7 d。

1.3 MDA对浮萍生长的影响

本试验按照经济合作与发展组织(OECD)化学品测试准则中的浮萍急性毒性试验方法(OECD 221)进行[10]。根据预试验的结果设置6个MDA浓度梯度，各试验浓度间隔系数为3.0，即0(空白对照)、0.6、1.8、5.4、16.2和48.6 mg·L-1。根据MDA在试验体系中的稳定性，选择了半静态的试验方式，每48 h更换一次MDA试验溶液，分别在0、48、96、144和168 h时测定新旧溶液的MDA浓度。取扩大培养后叶片完好、大小相近的3株3叶浮萍，采用灭菌SIS培养基对浮萍漂洗3遍，随机放入装有灭菌SIS培养基的200 mL培养瓶中，每个浓度设置3个重复。将所有培养瓶置于人工气候箱中培养，培养温度为(24±2) ℃，连续供光(光照度在85～135 μE·m-2·s-1)。试验期间，每天随机调整试验瓶的摆放位置，以减少由于光照不同导致的植物生长差异。

1.4 浮萍生长参数及各项生理指标的测定

试验期间MDA浓度采用Agilent 1260高效液相色谱仪进行测定(色谱柱：BDS HYPERSIL C18，100 mm×2.1 mm，2.4 μm)，柱温40 ℃；流动相10 mmol·L-1磷酸二氢钠-乙腈(V∶V=55∶45)，流速0.5 mL·min-1；进样量2.0 μL；检测器DAD；检测波长210 nm)。浮萍的生长参数包括浮萍的形态变化、叶状体数量、相对生长率、干质量和叶面积的测定。各项生理指标包括叶绿素含量、光系统Ⅱ(PSⅡ)最大光化学效应(Fv/Fm)、质膜透性、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的测定。浮萍干质量采用60 ℃烘干恒重法(前后2次质量相差≤0.4 mg)进行测定。浮萍叶面积采用软件Image J将影像数字化以得到浮萍的叶面积。

1.5 叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定采用丙酮提取法[11]。

1.6 叶绿素荧光参数测定

将浮萍进行暗适应30 min，采用植物效率分析仪测定荧光参数。打开调制测量光，测定最小荧光(F0)，然后打开饱和脉冲，测定最大荧光(Fm)，根据公式Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm计算PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)。

1.7 质膜透性测定

采用电导率法测定浮萍质膜透性[12]。

1.8 SOD、CAT和POD活性测定方法

SOD活性的测定采用氯化硝基四氮唑蓝(NBT)法[13]，POD活性的测定采用愈创木酚法[13]，CAT活性的测定采用紫外吸收法[14]。

1.9 数据处理

应用软件GraphPad Prism 5.0进行统计学分析，采用单因素方差分析(ANPVA)方法进行各试验组与对照组的显著性差异检验。P<0.05表示有统计学差异。

2 结果(Results)

2.1 MDA对浮萍生长的影响

MDA对浮萍的急性毒性试验结果如图1所示，MDA对浮萍叶片数、叶片生长率、叶片干质量和叶面积均有显著的抑制作用，且抑制程度与MDA的浓度呈正相关。MDA对浮萍叶片生长抑制的7 d半数效应浓度(7 d-EC50)为26.7 mg·L-1，其95%置信限为22.3～32.1 mg·L-1，基于叶片产量抑制的7 d-EC50为0.62 mg·L-1，其95%置信限为0.53～0.74 mg·L-1。基于总叶面积及干质量产量抑制的7 d-EC50均<0.6 mg·L-1。

2.2 MDA对浮萍叶绿素含量及光合活性的影响

植物叶片光合作用产物的积累很大程度上依赖叶绿素的含量。不同浓度MDA处理7 d后，发现浮萍叶绿素含量变化趋势与浮萍叶片干质量的趋势一致，随着MDA浓度的增加，浮萍总叶绿素含量逐渐下降(图2)。叶绿素荧光技术是一种灵敏的探针，可用于检测逆境胁迫对植物的危害程度[15]。PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)是叶绿素荧光动力学中重要且敏感的荧光参数[16]。采用便捷的植物效率分析仪检测MDA处理对浮萍Fv/Fm的影响。结果如图3所示，随着MDA浓度的增加，Fv/Fm逐渐降低。0.6、1.8、5.4、16.2和48.6 mg·L-1MDA处理的浮萍叶片Fv/Fm值分别是对照组的95.8%、93.5%、87.2%、81.9%和75.2%。

2.3 MDA对浮萍质膜透性的影响

采用不同浓度的MDA处理浮萍7 d，发现MDA能够增加浮萍质膜透性，0.6、1.8、5.4、16.2和48.6 mg·L-1MDA处理的质膜透性分别是对照组的1.26倍、1.44倍、1.79倍、2.19倍和2.82倍(图4(a))，说明MDA对浮萍质膜具有明显的慢性毒性作用。为进一步研究MDA是否对浮萍质膜具有直接毒性作用，将健康植物分别移入含有0.6、1.8、5.4、16.2和48.6 mg·L-1MDA的培养基中，并抽真空10 min以使MDA渗透到植物中，蒸馏水冲洗后，立即用电导仪测定整个植物的质膜渗透率。结果表明，直接毒性实验中测得的质膜透性与慢性毒性实验获得的结果相似(图4(b))，这表明MDA可以直接损伤细胞膜。

2.4 MDA对浮萍抗氧化酶活性的影响

MDA对浮萍SOD活性的影响如图5(a)所示，低浓度MDA处理7 d，浮萍的SOD活性无明显变化。当MDA浓度达到5.4 mg·L-1时，浮萍SOD活性显著增加。MDA对浮萍POD活性的影响如图5(b)所示，MDA浓度依赖地促进浮萍POD的活性。然而，当MDA浓度达到48.6 mg·L-1时，POD的活性显著降低。MDA对浮萍CAT活性的影响如图5(c)所示，低浓度MDA(0.6 mg·L-1)处理，浮萍的CAT活性无明显变化，随着浓度的增加，浮萍CAT活性逐渐上升，当MDA浓度达到16.2 mg·L-1时，浮萍CAT活性达到最高。

图1 4,4’-二氨基二苯基甲烷(MDA)对浮萍生长的影响注：(a)MDA对浮萍叶片数的抑制作用；(b)MDA对浮萍叶片生长率的抑制作用；(c)MDA对浮萍叶片干质量 的抑制作用；(d)MDA对浮萍叶面积的抑制作用(*P<0.05)。Fig. 1 The effects of 4,4’-methylenedianiline (MDA) on growth of L. minorNote:(a) Inhibitory effect of MDA on leaf number; (b) Inhibitory effect of MDA on leaf growth rate; (c) Inhibitory effect of MDA on leaf dry weigh; (d) Inhibitory effect of MDA on leaf area (*P<0.05).

图2 MDA对浮萍叶绿素含量的影响(* P<0.05)Fig. 2 The effects of MDA on chlorophyll contents of L. minor (*P<0.05)

图3 MDA对浮萍PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm) 的影响(*P<0.05)Fig. 3 The effects of MDA on the maximal photochemical efficiency of PSⅡ (Fv/Fm) of L. minor (*P<0.05)

3 讨论(Discussion)

生长抑制是有害物质检测的重要指标。本研究结果表明，虽然由MDA导致的浮萍死亡率不是很明显，但是它对浮萍的叶状体数量、叶片数生长率、叶片干质量和叶面积都有显著的抑制，说明MDA对浮萍生长具有显著性的抑制作用，且呈现剂量效应关系。

叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，其含量高低能够反映植物光合作用水平，体现了植株的生长势和抗逆性。叶绿素含量低，光合作用受到抑制使得植物不能正常新陈代谢，进而导致植物鲜重降低[17]。我们发现随着MDA处理浓度的升高，浮萍总叶绿素含量逐渐下降，结果与浮萍叶片干质量的变化趋势一致。Fv/Fm是叶绿素荧光动力学中重要且敏感的荧光参数，可较准确反映植物光合机构的状态，常用于评估光化学反应对环境胁迫的响应[16]。我们发现随MDA处理浓度的升高，Fv/Fm逐渐降低，进一步证实MDA胁迫能够抑制浮萍光合活性。

植物体细胞在正常代谢过程中会产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，ROS会对植物细胞的脂类、蛋白质和DNA等产生氧化损伤。植物细胞内存在相应的抗氧化酶系统，如SOD、POD和CAT等能有效地清除ROS，从而维持ROS动态平衡[18]。研究表明，植物的逆境条件会加剧ROS的产生和积累，当环境胁迫引起的ROS增加超出ROS清除系统的能力时，动态平衡就会被打破，引起膜脂质过氧化使得植物细胞结构和功能受到损伤，从而抑制植物生长[19-20]。我们发现低浓度MDA胁迫下，浮萍SOD、POD和CAT酶活性与对照组相近，说明此处理浓度所造成的胁迫尚未超出浮萍细胞内正常的ROS条件范围。但是低浓度MDA胁迫依然能够抑制浮萍叶绿素合成及光合活性，提示MDA可能通过其他的方式对浮萍产生毒性作用。通过测定浮萍质膜透性，我们发现MDA对浮萍质膜具有直接毒性作用，导致质膜透性增加，这可能是低浓度MDA处理导致光合活性降低的主要原因之一。与我们的研究结果相似，Kreslavski等[21]研究发现，多环芳烃(PAHs)对植物的毒性也与其对脂质双层膜的破坏有关。随着MDA浓度的进一步升高，浮萍SOD、CAT和POD酶活性增加，说明MDA处理导致浮萍氧化应激反应，以避免ROS对细胞的进一步损伤。当MDA浓度的达到48.6 mg·L-1时，POD活性显著降低，POD活性降低通常是植物受到严重氧化损伤的标志，说明此MDA浓度对浮萍产生了不可修复的伤害。综上所述，我们认为MDA能够直接损伤质膜，干扰叶绿体功能并抑制光合活性，而氧化损伤是质膜损伤引起的继发性应激，继而引起膜脂质过氧化加剧，质膜损伤，从而进一步抑制浮萍的生长。

图4 MDA对浮萍质膜透性的影响注：(a)慢性影响；(b)直接影响；*P<0.05。Fig. 4 The effects of MDA on plasma membrane permeability of L. minorNote: (a) chronic effect; (b) direct effect; *P<0.05.

图5 MDA对浮萍抗氧化酶活性的影响注：(a)MDA对浮萍超氧化物歧化酶(SOD)酶活性的影响；(b)MDA对浮萍过氧化物酶(POD)酶活性的影响； (c)MDA对浮萍过氧化氢酶(CAT)酶活性的影响；*P<0.05。Fig. 5 The effects of MDA on antioxidant enzyme activity of L. minorNote: (a) The effects of MDA on superoxide dismutase (SOD) activity; (b) The effects of MDA on peroxidase (POD) activity; (c) The effects of MDA on catalase (CAT) activity; *P<0.05.