塔里木裂腹鱼人工繁殖、胚胎发育和早期仔鱼发育研究

赵年桦,徐 筱,赵 贺,温子政,刘茂春,胡仁云,聂竹兰

(1.塔里木大学 动物科学学院,新疆阿拉尔 843300;2.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室,新疆阿拉尔 843300;3.塔里木珍稀鱼类研究中心,新疆阿拉尔 843300;4.武汉中科瑞华生态科技股份有限公司,武汉 430000)

塔里木裂腹鱼(Schizothorax bid dulphi)隶属于鲤形目(Cypriniformes),鲤科(Cyprinidae),裂腹鱼亚科(Schizothoracinae),裂腹鱼属(Schizothorax),是新疆的特种鱼类,因此被渔民称为“新疆鱼”,目前仅分布于新疆维吾尔自治区塔里木河水系,是塔里木河流域最具代表性的鱼类之一[1]。20世纪50年代,其种群数量曾在博斯腾湖达到最大值,占渔获物组成的80%,一度成为该湖最重要的经济鱼类之一[2]。20世纪70年代前后,塔里木裂腹鱼由于自身条件的限制,例如生长力度缓慢、性成熟晚、繁殖力低下以及对产卵场所和生活条件要求较高等,再加上人为条件和自然环境的约束,例如兴修水库、开垦荒地等,导致塔里木裂腹鱼的生存栖息地遭到严重迫害,因而种质资源和数量急剧减少[3],现博斯腾湖已无该鱼种,仅在塔里木河水系的渭干河、阿克苏河、和田河、克孜勒河、车尔臣河、叶尔羌河中存留,且数量极少。塔里木裂腹鱼在1998年作为新疆二级保护野生动物被收录于《中国濒危动物红皮书》[4],2004年被新疆维吾尔自治区列为II类水生保护动物,是中国特有的重要的珍稀鱼类之一[5]。

对濒危鱼类进行人工繁育与增殖放流,是保护该鱼类免遭灭绝的重要措施。此前,张人铭等[6]对新疆阿克苏河(Aksu River)的塔里木裂腹鱼进行人工繁殖试验,并其胚胎发育进行描述,龚小玲等[7]对新疆车尔臣河(Qarqan River)的塔里木裂腹鱼的胚胎和1～22 d仔鱼发育进行描述,二者均未对塔里木裂腹鱼出膜方式以及人工催产药物剂量进行研究。本试验于2020年将新疆克孜勒河(Kizil River)捕捞的野生塔里木裂腹鱼作为亲本,探究最佳人工催产药物浓度并对其胚胎发育和1～36 d仔鱼生长进行详细观察,进一步丰富塔里木裂腹鱼早期生活史,为其保护及增殖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点及亲鱼来源

繁殖用塔里木裂腹鱼亲鱼于2018年1-12月、2019年1-12月捕自克孜勒河流域,共捕获野生亲本1 365尾,其中体长为159.33～245.29 mm,体质量为65.34～170.02 g。试验于2020年4-6月在新疆察汗乌苏鱼类增殖站进行,选择雄性塔里木裂腹鱼亲鱼为3+以上,雌性塔里木裂腹鱼亲鱼为4+以上,雌雄亲鱼比例1∶2,养殖于循环水养殖池中(规格≥20 m3水深≥0.8 m、溶氧≥5 mg/L),期间投喂斯特徍生物活性饲料T2、T3,日投饵率为3%～5%。

1.2 人工催产

试验用鱼为健康雌鱼,共计960尾。采用显著性检验和响应面法,探究鲤鱼脑垂体(Pituitary gland,PG)、马来酸地欧酮(Domperidone,DOM)和促黄体素释放激素A2(Luteinizing hormone releasing hormone A2,LRH-A2)对塔里木裂腹鱼催产效果的单项调控和复合项调控作用。以PG、DOM、LRH-A2为催产剂,参照厚唇裂腹鱼(Schizothorax irregularis)[8]和细鳞裂腹鱼(Schizothorax chongi)[9]催产药物所需药量,设置各催产剂用量梯度。其中PG用量梯度为5、10、15、20和25 mg/kg;DOM用量梯度为5、10、15、20和25 mg/kg;LRH-A2用量梯度为10、15、20、25和30μg/kg。每个单项调控试验中设置3个试验组,每组10尾雌鱼。进行3种催产药物复合项调控试验时,采用3因素1水平的Box-Benhnken试验设计,因子水平分别为-1、0、1,试验点共17个,每个试验点共设置3组重复试验,每10尾雌鱼。通过试验结果分析建立塔里木裂腹鱼催产率(Y)与PG(A)、DOM(B)和LRH-A2(C)因素间的多元线性回归方程。

所有雌鱼进行催产时均采用胸鳍基部注射2针法,第1针注射总量的1/5,间隔12 h后,将剩下的4/5药量全部进行注射。整个试验用水为经过循环系统过滤的地下水,水温为(16.5±0.5)℃,p H为8.45～8.56,溶解氧为3.5～3.7 mg/L,盐 度 为0.17%～0.19%,氨 氮＜0.1 mg/L。

1.3 人工授精及孵化

采用干法进行授精。将受精卵均匀铺放在孵化框中(0.50 m×0.40 m×0.35 m),并放入孵化池中(5.00 m×0.45 m×0.50 m),采用淋浴式孵化法[8]进行孵化,水温变化控制在16.0～16.5℃,溶解≥8.0 mg/m L。

1.4 胚胎发育和早期仔鱼发育观察

选取同批次50粒受精卵进行胚胎发育观察研究,利用SMZ 1270数码体式显微镜观察受精卵发育各时期,以70%的受精卵进入相同发育时期作为一个发育期的判定;选取同批次受精卵发育出膜的仔鱼用于早期仔鱼发育观察研究,每次选取至少10条仔鱼,采用10%福尔马林溶液固定,在镜下进行观察记录并参照龚小玲等[7]划分仔鱼发育时期的方法进行塔里木裂腹鱼仔鱼发育时期的确定。

1.5 孵化效率评价

根据下列公式,计算塔里木裂腹鱼催产率、受精率和孵化率。

催产率=产卵尾数/催情总尾数×100%

受精率=原肠中期活卵数/产卵总数×100%

孵化率=鱼苗水花尾数/受精卵总数×100%

1.6 数据处理

卵径及各发育阶段的仔鱼全长的数据以“平均数±标准差”来表示。探究催产剂对塔里木裂腹鱼催产效果的单项调控和复合项调控作用时,其催产率结果使用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析,采用Duncan’s法进行多重比较,显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 对塔里木裂腹鱼催产率的单独调控结果

图1所示,在5～25 mg/kg PG用量区段间,塔里木裂腹鱼催产率随着用量上升而出现先增加后减少的趋势,在PG用量为10 mg/kg条件下,催产率达到最高,为(26.67±0.06)%;同样,在5～25 mg/kg DOM用量区段间,塔里木裂腹鱼催产率随着用量上升而同样出现先增加后减少的趋势,在DOM用量为15 mg/kg条件下,催产率达到最高,为(26.67±0.15)%;图2所示,当LHR-A2用量为25μg/kg时,塔里木裂腹鱼催产率达到最高,为(23.33±0.06)%。

2.2 最佳催产药物浓度筛选

响应面试验设计方案及结果见表1。塔里木裂腹鱼催产率(Y)与PG(A)、DOM(B)和LRHA2(C)因素间的多元线性回归方程为Y=-29.42A2-36.08B2-24.42C2-4.17AB+7.50AC+4.17BC-8.33A+1.67B-2.50C+78.00。回归模型决定系数R2为0.993 5,校正系数R2Adj为0.985 2,表明试验误差较小;模拟失效项P为0.568 4(P＞0.05),且根据PG、DOM和LRH-A23种因素对塔里木裂腹鱼催产率调控的响应面结果显示,PG和DOM、PG和LRHA2、DOM和LRH-A2对响应值(Y)的交互作用均呈开口向下的山丘状,二维等高线近圆形(图3),说明模型有效,可以很好分析和预测三种催产药物对塔里木裂腹鱼催产率的效果。本试验响应模型的优化结果显示,PG在13.47 mg/kg、DOM在15.27 mg/kg和LRH-A2在19.28μg/kg,此时塔里木裂腹鱼催产率理论值最高,为78.75%。经过验证,最优催产药物浓度下塔里木裂腹鱼催产率为(76.67±0.06)%,结果与理论催产率基本相符,说明响应模型方程可有效预测塔里木裂腹鱼催产率。

表1 响应面试验方案及结果(±s)Table1 Response surface design and results

表1 响应面试验方案及结果(±s)Table1 Response surface design and results

试验组Group编码值Code value(mg/kg)B-DOM/(mg/kg)C-LRH-A 2/(μg/kg)A-PG/催产率/%Induced spawning rate 1 1(25) 0(15) 1(30) 20.00±0.10 2 0(15) 0(15) 0(20) 73.33±0.06 3 0(15) 0(15) 0(20) 76.67±0.06 4 -1(5) 1(25) 0(20) 26.67±0.06 5 0(15) 1(25) 1(30) 23.33±0.06 6 0(15) 1(25) -1(10) 16.67±0.06 7 1(25) 1(25) 0(20) 0.00±0.00 8 0(15) 0(15) 0(20) 76.67±0.06 9 0(15) -1(5) 1(30) 10.00±0.10 10 1(25) -1(5) 1(20) 6.67±0.06 11 -1(5) 0(15) 1(30) 20.00±0.10 12 1(25) 0(15) -1(10) 13.33±0.06 13 0(15) 0(15) 0(20) 83.33±0.06 14 0(15) 0(15) 0(20) 80.00±0.10 15 -1(5) -1(5) 0(20) 16.67±0.06 16 0(15) -1(5) -1(10) 20.00±0.00 17 -1(5) 0(15) -1(10) 43.33±0.11

2.3 塔里木裂腹鱼胚胎发育

胚胎发育包括早期胚胎发育(受精、卵裂、桑葚胚、囊胚、原肠胚、神经胚期、胚孔闭合期)以及器官发生(肌节出现期、眼囊期、耳囊期、尾芽期、肌肉效应期、心跳期、出膜期)共14个时期(图4),在水温19～19.2℃条件下,历时93 h 36 min发育为仔鱼,总积温为1 785.24℃·h(表2)。

2.4 塔里木裂腹鱼早期仔鱼发育

鱼苗出膜进入仔鱼期,仔鱼出膜4 d后进入平游期。本试验对1～36 d仔鱼发育进行观察,将对1～36 d仔鱼发育划分为以下几个时期。

2.4.1 卵黄囊期(1～6 d龄) 1 d仔鱼体透明,全身无色素,体长为(7.21±0.16)mm(图5-1 d);2 d仔鱼眼球色素出现(图5-2 d);3 d仔鱼消化道贯通(图5-2 d);4 d仔鱼开始平游,眼球色素明显加深(图5-4 d);6 d仔鱼卵黄囊体积明显缩小,背部出现黑色素(图5-6 d)。

2.4.2 弯曲前期(7～17 d龄) 7 d仔鱼卵黄囊被吸收完全,鳔充气膨大,尾鳍条开始出现(图5-7 d);11 d仔鱼身体前部、中部、尾部均可见黑色素分布(图5-11 d);17 d仔鱼肠道前端开始弯曲(图5-17 d)。

2.4.3 弯曲期(18～26 d龄) 18 d仔鱼背鳍褶缩小,脊椎向上弯曲形成鳔前室(图5-18 d);19 d仔鱼出现背鳍条,臀鳍褶缩小形成独立臀鳍,尾鳍开始分叉(图5-19 d);26 d仔鱼尾鳍叉形明显(图5-26 d)。

2.4.4 弯曲后期(27～36 d龄) 27 d仔鱼尾鳍叉形逐渐加深(图5-27 d);31 d仔鱼背鳍与臀鳍全部形成(图5-31 d);34 d仔鱼腹鳍条开始出现(图5-34 d);36 d仔鱼腹鳍形成完全,尾下骨与脊索完全垂直,此时仔鱼全长为(19.42±0.87)mm(图5-36 d)。

2.5 塔里木裂腹鱼人工繁殖试验结果

2020年4月23日至6月3日在察汗乌苏鱼类增殖放流站催产塔里木裂腹鱼亲鱼44组,进行5批次塔里木裂腹鱼人工繁殖试验,如表3所示,共获取成熟卵粒25.08万粒,平均催产率为59.09%,平均受精率为68.78%,平均孵化率86.37%,获水花鱼苗14.9万尾。

表3 塔里木裂腹鱼人工繁殖试验Table3 Artificial propagation test of S.biddulphi

3 讨论

3.1 人工催产

对野生珍稀鱼类进行人工驯养和繁殖是保护濒危物种的重要手段,但大多数野生鱼类在人工饲养时,不能顺利实现自我繁衍[10]。在人工调控的环境条件下,对鱼类注射人工合成激素,是实现鱼类繁殖和人工助产的有效途径之一[11-12]。鱼类人工催产时的效率受鱼的品种、催产药物种类及剂量和水温等因素的影响,合适的催产药物种类及剂量可以有效提高催产率[13-14]。本试验中塔里木裂腹鱼催产药物种类及剂量与拉萨裂腹鱼(Schizothorax waltoni)[LRH-A2(10μg/kg)+DOM(10 mg/kg)][14]、昆明裂腹鱼(Schizothorax grahami)[LRH-A2(220μg/kg)+HCG(1 500 IU/kg)+DOM(10 mg/kg)][15]、重口裂腹鱼[Schizothorax(Racoma)davidi][RH-A2(10μg/kg)+DOM(2 mg/kg)][16]、四川裂腹鱼(Schizothorax kozlovi)[LRH-A2(15μg/kg)+PG(5 mg/kg)+HCG(1 500 IU/kg)][17]、双须叶须鱼(Ptychobarbus dipogon)[RH-A2(6μg/kg)+PG(3 mg/kg)][18]等裂腹鱼亚科鱼类差别较大,催产水温在裂腹鱼亚科鱼类中属于较高水平。推测由于鱼的种类、所用催产药物及剂量、水温不同,造成鱼类催产效率也各不相同。如何有效提高裂腹鱼亚科鱼类人工催产效率,有待进一步研究。

在实际生产中,催产素的综合使用是提高塔里木裂腹鱼产卵率的有效方法,根据亲鱼的发育情况,可以选择1～2次注射。发育较好的亲鱼可以进行1次注射,发育较差的亲鱼和初产鱼则必须进行2次注射[12]。塔里木裂腹鱼亲本催产前,需投喂高蛋白饵料以保证亲鱼的强化培育。催产后,亲鱼有时会因应激反应过强而死亡,所以在生产过程中,需要将催产后的塔里木裂腹鱼尽快放入高溶氧的养殖池中,等其体质恢复后,再放入土池塘中进行饲养。塔里木裂腹鱼为国家濒危保护鱼类,野外种质资源十分稀少,人工繁殖又需要进行野外引种,这将对野生种群造成极大破坏。因此,有效提高亲鱼的催产率和产后成活率,对塔里木裂腹鱼的保护具有重大意义。

3.2 不同河流中塔里木裂腹鱼的胚胎发育差异

将克孜勒河塔里木裂腹鱼与阿克苏河[6]、车尔臣河[7]塔里木裂腹鱼胚胎发育进行比较(表5):三者卵径、初孵仔鱼长度、卵黄消失时间相近,说明三个地理的塔里木裂腹鱼种群繁殖性状较为相似;克孜勒河和车尔臣河塔里木裂腹鱼胚胎发育历时相近,而阿克苏河塔里木裂腹鱼胚胎发育历时较长,为101.9 h;克孜勒河塔里木裂腹鱼出膜时前已经形成心脏、胸鳍原基和血液循环,而车尔臣河群体出膜前仅出现肌肉效应,阿克苏河群体出膜前只出现心脏搏动,三个地理种群胚盘发育历时和出膜时发育阶段不同。克孜勒河塔里木裂腹鱼人工孵化水温较高,始终维持在19～19.2℃,而车尔臣河塔里木裂腹鱼孵化最低水温为16℃,阿克苏河塔里木裂腹鱼孵化最低水温为14℃,推测可能孵化水温不同,造成了不同地理群体胚胎发育时间和出膜时发育阶段的存在差异。

温度是影响鱼类生殖的关键因素之一[19-20]。水温调控性腺发育成熟具有完整的机制:适宜的温度可以促使鱼类的下丘脑分泌促性腺激素释放激素(Gn RH),激发垂体分泌促性腺激素(GTH)作用于性腺,性腺接受信号后分泌性类固醇激素,诱导性腺发育成熟并排出卵子或精子[21-22]。当水温过高或者过低时,该机制的启动会受到极大的影响,导致人工催产效率下降,鱼类也会因此出现排卵困难或难产的情况[23]。本研究验证最优催产药物浓度时,于(16.5±0.5)℃水温条件下催产率则达到(76.67±0.06)%,推测塔里木裂腹鱼在16℃左右的水温条件下,对外源激素敏感性上升,性腺加快成熟,人工催产效率提高,亲鱼更容易排出卵子或精子。探索塔里木裂腹鱼人工催产所需的最适水温,是提高人工繁殖效率的关键。

3.3 塔里木裂腹鱼与其他裂腹鱼亚科鱼类的胚胎发育差异

将塔里木裂腹鱼与厚唇裂腹鱼(S.irregularis)[8]、齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)[24]、重口裂腹鱼[S.(Racoma)davidi][25]、异齿裂腹鱼(Schizothorax oconnori)[26]、扁吻鱼(Aspiorhynchus laticeps)[27]等其他裂腹鱼亚科鱼类胚胎发育进行比较:由于裂腹鱼亚科是栖息在高海拔和低温水域环境中的冷水性鱼类,其繁殖生育水温也相对较低,所以裂腹鱼亚科鱼类胚胎发育温度较低,均未超过22℃[8,24-27];塔里木裂腹鱼胚胎发育用时最短,可能鱼类品种不同可能造成了胚胎发育用时存在差异;塔里木裂腹鱼的受精卵卵径在几种裂腹鱼亚科鱼类属于较小类型,较小卵径在一定程度上缩短了塔里木裂腹鱼孵化时间,加快塔里木裂腹鱼发育为仔鱼的速度,有利于其更早适应外界环境[28-29]。出膜阶段时塔里木裂腹鱼、齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)和扁吻鱼(Aspiorhynchus laticeps)处于血液循环器,厚唇裂腹鱼处于胸鳍原基期,重口裂腹鱼处于心脏搏动期,异齿裂腹鱼(Schizothorax oconnori)处于心脏原基期。塔里木裂腹鱼在胚胎发育的过程中心脏、胸鳍原基及血液循环均在孵化出膜前形成,这有利于其仔鱼更好地适应外界环境[30]。塔里木裂腹鱼、厚唇裂腹鱼和重口裂腹鱼都是尾部先出膜,齐口裂腹鱼、异齿裂腹鱼和扁吻鱼出膜方式均为头部或尾部出膜,笔者推测出膜方式可能与鱼类品种有关。

3.4 塔里木裂腹鱼与其他裂腹鱼亚科鱼类的仔鱼发育差异

塔里木裂腹鱼初孵仔鱼最短,推测塔里木裂腹鱼初孵仔鱼在裂腹鱼亚科中属小型。较小体型可以灵活游动,进入岩石等狭缝躲避捕食者猎食[31-32];塔里木裂腹鱼仔鱼出膜后7 d后卵黄囊消耗殆尽,时间较短。卵黄囊营养吸收较快,有利于鱼体迅速生长和新陈代谢,促进仔鱼器官分化和运动[33]。塔里木裂腹鱼在卵黄囊消失前消化道完全贯通,7 d后,仔鱼口、鳃和尾鳍快速发育,孵化后36 d,塔里木裂腹鱼各鳍已基本长成,进入幼鱼阶段。关于塔里木裂腹鱼卵黄囊确切机制有待于进一步研究。