ZEN污染饲料中添加植物炭黑对大鼠脏器组织、抗氧化指标及免疫功能的影响

刘淑杰，邓 波，吴 杰，徐子伟*，马倩倩

（1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江杭州 310021；2.东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨 150036）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是由镰刀属真菌产生、具有类雌激素活性的次级代谢产物。ZEN可与机体内的雌激素受体结合，迅速激活雌激素的反应元件，对动物和人产生强烈的生殖毒性，造成繁殖功能障碍。ZEN还具有较强免疫毒性，能降低动物血液抗体水平，扰乱细胞因子正常分泌。另外，ZEN能改变动物血清抗氧化酶活性和活性氧水平（ROS），导致脂质过氧化，造成机体氧化应激损伤。ZEN高污染率、超标率和强烈致毒性给畜牧业造成不可估量的经济损失，向ZEN污染饲料中添加吸附剂是一种经济、环保且高效的脱毒方法。目前常采用硅铝酸盐类吸附剂，但这些吸附剂对霉菌毒素具有选择性吸附，对ZEN、烟曲霉毒素及单端孢霉烯族毒素等的吸附性较弱，甚至不吸附。因此，研发新型且吸附力强的霉菌毒素吸附剂成为研究重点。植物炭黑主要由稻草、麦秸和杂草等不完全燃烧产生，无毒，微孔结构多，比表面积大，对毒素、有害微生物等具有很强吸附力，极有可能成为一种新型、高效的霉菌毒素吸附剂。鉴于此，本研究以SD大鼠为试验动物，向ZEN污染的饲料中添加不同水平的植物炭黑，研究其对大鼠脏器组织、抗氧化指标及免疫功能的影响，为植物炭黑应用于畜禽生产及饲料行业提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 植物炭黑由福建省顺昌碳娃娃生物科技有限公司提供，ZEN（编号17924-92-4）购自加拿大Triplebond Corporation公司。白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-（TNF-）、总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（编号分别为H002、H003、H009、H052、A001-1、A003-1、A005和A015）购自南京建成生物工程研究所。

1.2 试验设计 64只5～6周龄SPF级SD雌性大鼠购自浙江省实验动物中心，体重约150 g。大鼠单笼饲养，饲养环境温度为（23±2）℃，相对湿度40%～70%，光照周期12 h明、12 h暗，氨气浓度≤14 mg/mL，自由采食和饮水。大鼠随机分为4个处理，每个处理16个重复，每个重复1只。试验组分别为空白对照组（基础日粮）、负对照组（基础日粮+ZEN 25 mg/kg）、低剂量植物炭黑组（基础日粮+ZEN 25 mg/kg+1 g/kg 植物炭黑）、高剂量植物炭黑组（基础日粮+ZEN 25 mg/kg+1.5 g/kg 植物炭黑）。适应期7 d，第8天开始正式试验，正试期28 d。基础日粮购自浙江省实验动物中心，日粮组成及营养水平如表1。

表1 基础日粮组成及营养水平

1.3 测定指标和方法

1.3.1 血清细胞因子水平 在试验第14天和第28天，所有试验大鼠眶下静脉采血，在4℃条件下放置12 h，然后3 000 r/min离心15 min，收集血清，-80℃保存备用。采用ELISA方法测定血清细胞因子IL-1、IL-2、IL-10和TNF-浓度，根据试剂盒操作说明进行检测。

1.3.2 组织病理学检测与脏器指数 在试验第14天和28天，各组分别取8只大鼠处以安乐死，迅速剖开腹腔，剖取大鼠的肝脏、胸腺、脾脏、肾脏、卵巢和子宫组织进行称重，记录数据并计算脏器指数，脏器指数=（器官鲜重/活重）×100%。然后取大鼠右侧子宫和肝脏，截取子宫中段，长度3～5 cm，截取宽度约1 cm的肝脏组织，用生理盐水冲洗干净，然后将子宫和肝脏组织放入10%中性甲醛溶液中，石蜡包埋后切片，苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosinstaining，HE）染色，显微镜下观察大鼠子宫和肝脏结构形态，用于病理学分析。

1.3.3 肝脏抗氧化指标 在试验第14天和28天，取安乐死大鼠的肝脏，准确称取组织重量，按重量体积比加入10倍的生理盐水，制成组织匀浆，2 500 r/min离心10 min，取上清液，采用分光光度法测定T-AOC和MDA浓度、GSH-Px和SOD活性。

1.4 统计分析 采用SPSS 21.0进行单因素方差分析（Oneway ANOVA），Duncan′s法多重比较，结果以平均值±标准差表示，＜0.05表示差异显著，＜0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 ZEN污染饲料中添加植物炭黑对大鼠子宫和肝脏组织学影响 由图1可知，在试验第14天和第28天，空白对照组的子宫结构清晰，分层清楚，子宫内膜呈明显波浪形，内陷较浅且较少，宫腔相对较小，固有层中有少量腺体。与对照组比较，负对照组子宫结构尚存在，但内膜明显内陷深而且多，腺体数量明显增多，腺腔变大；试验第14天和第28天低剂量植物炭黑组和高剂量组的子宫情况较负对照组明显好转。

图1 ZEN污染饲料中添加植物炭黑对大鼠子宫组织学影响

由图2可知，试验第14天和第28天，空白对照组肝脏组织结构清楚，肝细胞呈放射状排列，肝细胞未见明显的变性、坏死；肝血窦存在内见少量红细胞，汇管区未见炎症细胞浸润和纤维组织增生；负对照组肝组织结构尚清楚，肝细胞明显浊肿变性，部分甚至空泡化，少量脂肪变性、偶见点状坏死，未见灶性和桥接坏死，部分肝细胞核固缩、凋亡；肝血窦变小或消失；汇管区偶可见少量炎症细胞浸润，未见纤维组织增生。低剂量植物炭黑组和高剂量组的肝脏损伤程度较负对照组均有减轻，其中高剂量组更为明显。

图2 ZEN污染饲料中添加植物炭黑对大鼠肝脏组织学影响

2.2 ZEN污染饲料中添加植物炭黑对大鼠脏器指数影响由表2可知，在试验第14天和28天，与空白对照组相比，负对照组大鼠的肝脏、胸腺、脾脏、肾脏、卵巢和子宫的脏器指数无显著变化；与负对照组和空白对照组相比，低剂量植物炭黑组和高剂量组大鼠肝脏、胸腺、脾脏、肾脏、卵巢和子宫的脏器指数无显著变化。

表2 ZEN污染饲料中添加植物炭黑对大鼠脏器指数影响 %

2.3 ZEN污染饲料中添加植物炭黑对大鼠肝脏抗氧化指标影响 由表3可知，在试验第14天和第28天，与空白对照组相比，负对照组肝脏SOD活性分别降低了12.34%（＜0.01）和7.06%（＜0.05）；在试验第14天，高剂量植物炭黑组SOD活性比负对照组升高了8.01%（＜0.05）。在试验第14天和第28天，与空白对照组相比，负对照组MDA浓度分别升高了30.28%（＜0.05）和29.66%（＜0.01）；在试验第28天，高剂量植物炭黑组MDA浓度比负对照组降低了16.99%（＜0.01）。在试验第14天和第28天，与空白对照组相比，负对照组GSH-Px活性分别降低了59.72%和26.85%（＜0.01）；高剂量植物炭黑组GSH-Px活性较负对照组分别升高了40.27%和29.78%（＜0.01）。在试验第14天，负对照组T-AOC浓度较空白对照组降低了53.85%（＜0.01）；与负对照组相比，低剂量植物炭黑组和高剂量组T-AOC浓度均升高了66.67%（＜0.01）；在试验第28天，各组间T-AOC浓度差异不显著。

表3 ZEN污染饲料中添加植物炭黑对大鼠肝脏抗氧化指标影响

2.4 ZEN污染饲料中添加植物炭黑对大鼠血清细胞因子浓度影响 由表4可知，在试验第14天和第28天，负对照组血清IL-2浓度较空白对照组分别升高了17.38%和13.85%（＜0.01），高剂量植物炭黑组IL-2浓度较负对照组分别降低了28.00%和17.38%（＜0.01）。在试验第14天和第28天，负对照组的IL-10浓度较空白对照组分别降低了18.96%（＜0.01）和13.73%（＜0.05）；在试验第14天，低剂量植物炭黑组和高剂量组的IL-10浓度较负对照组分别升高了20.32%和20.99%（＜0.01）。在试验第14天，负对照组的TNF-浓度较空白对照组升高了20.91%（＜0.01），高剂量组TNF-浓度与其他各组差异不显著；在试验第28天，各组间TNF-浓度差异不显著。

表4 ZEN污染饲料中添加植物炭黑对大鼠血清细胞因子浓度影响

3 讨 论

3.1 ZEN污染饲料中添加植物炭黑对大鼠脏器组织影响ZEN具有较强的生殖毒性，能够引起动物生殖器官结构形态改变，导致生殖系统功能障碍。研究显示，ZEN可诱导不同时期小鼠子宫细胞凋亡，上调Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Bcl-2表达。饲料中含有0.5 mg/kg ZEN能够使断奶小母猪子宫肌层和内膜明显增厚，子宫腺数量明显增多，子宫形态改变。本研究结果显示，与对照组相比，负对照组的子宫结构尚存在，但内膜明显内陷深而且多，腺体数量明显增多，腺腔变大，与前人报道结果相似。ZEN对子宫损伤程度与其剂量、动物种类及所处生理状态相关，在本试验中第14天和28天，ZEN污染饲料中添加低剂量和高剂量植物炭黑组大鼠的子宫形态结构明显好转，说明植物炭黑缓解了由ZEN造成的子宫不利影响，对子宫结构和功能具有改善作用。

肝脏是ZEN代谢的主要器官，当动物长期采食过量ZEN可造成肝脏损伤病变。研究显示，1 mg/kg ZEN可导致断奶小母猪肝脏中央静脉周围的肝细胞出现泡状变性，淋巴浸润。50 mg/kg ZEN可导致发情期小鼠肝细胞索发生紊乱，肝细胞脂肪变性，部分肝细胞核体积增大，双核肝细胞增多，可见局灶性坏死。本研究结果显示，负对照组肝细胞明显浊肿变性，部分甚至空泡化，少量脂肪变性，部分肝细胞核固缩、凋亡，肝血窦变小或消失，汇管区偶可见少量炎症细胞浸润；而低剂量植物炭黑组和高剂量组的肝脏损伤情况较负对照组均有所减轻，其中以高剂量组最为明显，说明植物炭黑对肝脏具有保护作用。

本研究显示，大鼠采食ZEN污染饲料对肝脏、子宫、胸腺和脾脏等脏器指数无显著影响。姚宝强研究显示，饲料中添加1 mg/kg ZEN对肝脏、肾脏、脾脏等器官指数无影响。灌服40 mg/kg BW ZEN的小鼠子宫和肾脏指数显著升高，脾脏和肝脏指数显著降低。饲喂含有500 μg/kg ZEN饲料28 d可显著降低雌性大鼠脾脏指数，饲喂含有300、400、500 μg/kg ZEN饲料42 d后肝脏指数显著低于对照组，肾脏指数无显著变化。这些说明ZEN可导致动物组织器官萎缩或发育不全，而影响程度与ZEN浓度和动物摄入持续时间有关。本研究中，病理切片结果显示ZEN对子宫和肝脏有不同程度损伤，但大鼠采食含有25 mg/kg ZEN饲料及不同剂量的植物炭黑饲料对子宫、肝脏以及各脏器指数无显著影响。

3.2 ZEN污染饲料中添加植物炭黑对肝脏抗氧化指标影响 正常生理状态下机体存在抗氧化系统，能够及时清理产生过多的自由基，使得氧化与抗氧化系统保持动态平衡。当动物摄入过量ZEN可造成机体自由基浓度过高，从而引起氧化应激反应，造成组织器官氧化损伤。高鑫研究发现，饲料中含有10 mg/kg和20 mg/kg ZEN可著降低妊娠期母鼠血清SOD和GSH-Px活性，提高MDA浓度；饲料中含有 1.0 mg/kg ZEN可显著增加断奶仔猪肝脏MDA浓度，显著降低T-AOC浓度、SOD和GSH-Px活性，这与本试验结果一致。以上说明，ZEN引起大鼠氧化应激反应，造成自由基的产生超过机体的清除能力，对大鼠肝脏造成氧化损伤，这与肝脏的组织切片病理结果相一致。

向霉菌毒素污染饲料中添加吸附剂可不同程度缓解毒素对动物机体造成的氧化损伤。高鑫研究显示，向饲料中添加水飞蓟素可缓解由ZEN导致的大鼠肝脏MDA浓度升高，SOD和GSH-Px活性下降。向ZEN污染饲料中添加0.2%霉菌毒素脱毒剂BZ可显著提高肉鸡血清GSH-Px活性，降低MDA浓度。向含有0.4 mg/kg ZEN饲料中添加0.15 %改性蒙脱石吸附剂CA能够提高血清GSH-Px和SOD活性，降低MDA浓度。本研究结果显示，向ZEN污染饲料中添加低剂量植物炭黑显著提高了试验第14天T-AOC浓度，对MDA浓度、SOD和GSH-Px活性具有改善的趋势；添加高剂量植物炭黑显著提高第14天SOD活性，极显著提高T-AOC浓度，极显著提高第14天和第28天的GSH-Px活性，极显著降低第28天MDA活性，说明添加高剂量植物炭黑能够有效吸附饲料中的ZEN，增强了机体对自由基的清除能力，改善由ZEN所导致对肝脏的氧化损伤。

3.3 ZEN污染饲料中添加植物炭黑对血液免疫指标影响 ZEN具有较强的免疫毒性，能够引起机体炎症反应，损伤免疫系统。研究显示，ZEN可增加断奶仔猪脾脏TNF-、IL-8、IL-6和IL-1mRNA表达量。饲料中含有150 mg/kg ZEN可增加怀孕大鼠脾脏IL-6、IL-18和IL-1mRNA表达量，降低TNF-、IFN-和IL-10 mRNA表达量。饲料中含有1 mg/kg ZEN显著降低断奶仔猪外周血和脾脏淋巴细胞增殖率以及IL-2浓度。由于不同种类动物对ZEN的敏感性、摄入剂量和持续时间不同，ZEN免疫毒性也呈现很大差异。本研究显示，ZEN极显著增加了试验第14天和第28天血清IL-2浓度，极显著降低第14天IL-10浓度，显著降低第28天IL-10浓度，极显著增加第14天TNF-浓度。说明饲料中含有25 mg/kg ZEN可诱导大鼠炎症反应，造成细胞因子浓度改变，对免疫系统造成一定的损伤。

向霉菌毒素污染饲料中添加吸附剂可不同程度提高动物机体免疫力。本研究显示，向ZEN污染饲料中添加低剂量植物炭黑显著降低了试验第14天大鼠血清TNF-浓度，极显著提高IL-10浓度；高剂量植物炭黑能够极显著降低第14天和第28天IL-2浓度，极显著提高第14天的IL-10浓度，显著降低第14天的TNF-浓度，且与空白对照组相比差异不显著。关于吸附剂调节ZEN诱导炎症反应的文献报道较少，李丹等研究显示，饲料中添加0.2 mg/kg和0.4 mg/kg壳聚糖硒可降低ZEN导致的小鼠血浆TNF-a和IL-18浓度升高。向含有1 mg/kg ZEN饲料中添加4 g/kg改性蒙脱石可显著改善ZEN诱导的脾脏和外周血淋巴细胞增殖率以及IL-2浓度改变。本试验中，植物炭黑降低了ZEN对大鼠的毒性作用，通过调节TNF-、IL-10和IL-2浓度来缓解ZEN所诱导的炎症反应，提高机体免疫功能，并且高剂量植物炭黑效果优于低剂量。

4 结 论

本试验结果显示，植物炭黑能够改善采食ZEN污染饲料大鼠的子宫、肝脏形态结构，提高了机体抗氧化功能和免疫功能，缓解ZEN对机体的损伤，推荐植物炭黑适宜添加剂量为1.5 g/kg。