没食子酸和三甲胺N-氧化物对体外瘤胃发酵和三甲胺代谢的影响

2022-01-20成海建姜富贵宋恩亮

中国畜牧杂志 2022年1期

魏晨，成海建，姜富贵，靳青，宋恩亮*

（1.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南 250100；2.山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南 250100）

三甲胺（CHN，TMA）是拥有3个甲基基团的含N物质，是一种低嗅阈值的臭味气体，也是肉牛场最主要的有机胺类污染物，对动物和人的健康产生不利影响。对反刍动物而言，TMA主要在瘤胃发酵和粪尿等排泄物堆放过程中产生，其中，瘤胃中的TMA来源于两部分，一是源于瘤胃微生物对精料中丰富的具有N-三甲基结构的胆碱、肉碱、甜菜碱、腺苷甲硫氨酸等前体物质的分解，二是体内三甲胺N-氧化物（TMAO）随唾液返回瘤胃后被TMAO还原酶分解产生。瘤胃中产生的TMA一部分被微生物分解产生氨和甲烷，另一部分通过瘤胃壁吸收进入体内后转化为TMAO，再通过唾液返回瘤胃或随尿液排出，TMA还会随动物呼吸直接排出体外。因此，有效减少瘤胃TMA的产生将有利于环境保护和人畜健康。

单宁属于多酚类物质，在植物中分布十分广泛。没食子酸（3,4,5-三羟基苯甲酸，GA）是单宁的主要活性单体之一，具有减少蛋白质在瘤胃中无效降解的保护特性。也有研究表明，单宁的酚羟基还能与胺N-氧化物结合，是TMAO等物质的高效吸附剂。然而，GA是否能通过抑制饲料中前体物质分解或保护随唾液进入瘤胃的TMAO，从而减少瘤胃TMA的产生还未见相关报道。此外，随唾液返回瘤胃的TMAO对瘤胃发酵过程产生的影响还不清楚。因此，本试验通过体外试验模拟瘤胃发酵过程，将高精料饲粮作为发酵底物，研究添加GA和TMAO对体外瘤胃发酵和TMA代谢的影响，为通过营养途径改善瘤胃发酵和调控瘤胃TMA代谢提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与动物 GA（G131992，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）纯度99%，TMAO[317594，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司]纯度95%。选用3头3周岁、平均体重为（473±15）kg、安装有永久性瘤胃瘘管的利鲁公牛（利木赞牛×鲁西黄牛）作为试验动物，饲喂由70%全株玉米青贮和30%精料组成的饲粮[干物质（DM）基础]，试验动物饲粮按《肉牛营养需要和饲养标准》制定，原料组成及营养成分与文献一致，每天07:00和17:00各喂1次，自由采食，自由饮水。

1.2 试验设计与采样参考Wei等和Aii等的试验处理或结果，采用完全随机化设计，设置对照组、15 mg GA/g DM组、5 mg TMAO/g DM组、5 mg TMAO+15 mg GA/g DM组。底物由70%精料和30%全株玉米青贮组成，原料组成及营养成分见表1。称取粉碎后过2 mm筛的底物1.0 g（DM基础），放入已标记、用丙酮浸洗过并称重的Ringbio滤袋中并封口，每个处理4个重复，另设2个空白对照（只有滤袋）。早上饲喂前，通过瘤胃瘘管分别从瘤胃的不同位置采集3头牛的瘤胃食糜，用4层纱布过滤，混合均匀，并立即放入厌氧密闭保温瓶中，带回实验室，置于39℃恒温水浴中。进行培养前，将滤袋放入培养瓶，参照Goering等的方法配置无氧培养液。用分液器将15 mL瘤胃液和45 mL预热培养液（1:3）加入125 mL培养瓶中。用橡胶塞和压接铝帽密封后，置于120 r/min、39℃恒温振荡器中培养24 h。在培养开始后的4、8、12、18、24 h，用测压计（06-664-21，Fisher Scientific Inc.）测定每个培养瓶的气压值。采集2、4、8、12 h瘤胃发酵液，-80℃保存，用于测定三甲胺氮（TMA-N）。培养24 h后，将各培养瓶置于冰上终止发酵。将发酵24 h滤袋从瓶中取出，用蒸馏水冲洗干净，置于65℃烘箱中48 h，用以计算DM消失率（DMD），随后测定粗蛋白质消失率（CPD）。用pH计（HI 9125，Hanna Instruments Inc.）测定每个培养瓶中发酵液的pH后，取1 mL上清液与0.2 mL 25%偏磷酸混匀，置于-20℃保存，进行挥发性脂肪酸（VFA）测定。取1 mL上清液与0.2 mL 1%硫酸混匀，置于-20℃保存，用于氨态氮（NH-N）测定。

表1 体外发酵底物原料组成及营养成分（风干基础） %

1.3 化学分析将底物样品粉碎，过1 mm筛，参照AOAC（1990）的方法测定DM、OM含量。采用凯氏定氮法测定底物和残渣总氮（N）含量，并计算CP含量。参照Van Soest等的方法测定底物NDF和ADF含量。根据Topuz等的方法，使用分光光度计（ULTROSPEC-3100，Amersham）于410 nm处测定各时间点发酵液TMA-N浓度。参照Erwin等的气相色谱分析法，使用气相色谱仪（Model 7890A，Agilent Technologies）测定发酵液样品中VFA含量。采用Chaney等提出的方法测定发酵液氨态氮（NH-N）浓度。

1.4 数据计算与统计采用Mauricio等提出的方程计算各气压值对应的产气量，并进行空白对照校正，总产气量为各气体采样时间点的产气量之和：

产气量（mL）=0.18+[3.697×气压值（psi）]+[0.082 4×气压值平方（psi）]

进行空白对照校正后，每个处理组累积TMA-N浓度为各组瘤胃发酵液采样时间点TMA-N浓度之和。

采用SAS 9.1中混合模型的重复测量数据程序分析各时间点TMA-N浓度，采用一般线性模型对底物消失率、总产气量、各发酵参数、累积TMA-N浓度进行方差分析，采用Duncan′s法比较各组均值，≤0.05表示差异显著，＜0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 GA和TMAO对体外24 h瘤胃底物消失率和产气量的影响由表2可知，各组间DMD无显著差异，但添加TMAO有提高底物DMD的趋势（=0.08）。TMAO组和TMAO+GA组底物CPD高于其他两组（＜0.01），且以TMAO组最高；与对照组相比，添加GA降低了CPD（＜0.01）。TMAO组总产气量高于其他各组（＜0.05），其他组间无显著差异。

表2 GA和TMAO对体外24 h瘤胃底物消失率和产气量的影响

2.2 GA和TMAO对体外24 h瘤胃发酵参数的影响由表3可知，与对照组相比，添加TMAO有降低pH（=0.06）和提高TVFA浓度（=0.09）的趋势。TMAO组和TMAO+GA组的NH-N浓度高于对照组（=0.0）5，且TMAO组最高，GA组的NH-N浓度低于对照组（=0.05）。与对照组相比，其他三组的异戊酸摩尔比例有降低趋势（=0.08）。

表3 GA和TMAO对体外24 h瘤胃发酵参数的影响

2.3 GA和TMAO对体外瘤胃各时间点和累积TMA-N浓度的影响由表4可知，TMA主要在瘤胃发酵8 h前产生。与对照组相比，GA组的TMA-N浓度无显著差异，添加TMAO提高了2 h TMA-N浓度（＜0.01），有提高4 h TMA-N浓度的趋势（=0.07）。TMAO+GA组2 h 的TMA-N浓度高于对照组和GA组（＜0.01），低于TMAO组。添加TMAO组的累积TMA-N浓度最高，TMAO+GA组次之，对照组和GA组间无显著差异且最低。

表4 GA和TMAO对体外瘤胃各时间点和累积TMA-N浓度的影响

3 讨论

3.1 GA和TMAO对体外瘤胃发酵的影响营养物质消失率和产气量是瘤胃发酵作用的直接反映。有研究表明，GA能够被瘤胃微生物分解，并作为能源物质被利用，添加40 mg GA/kg DM能够显著提高底物（精粗比为50:50）48 h的DMD和总产气量，然而本试验的结果与此并不一致，可能的原因是本试验中GA的添加剂量为15 mg/kg DM，低于前者，且底物组成不同（精粗比为70:30）、瘤胃发酵时间（24 h）也较短，导致GA对瘤胃发酵过程的促进作用不明显。TMAO对瘤胃发酵的影响还未见相关报道。与GA作用效果不同，本试验中添加5 mg/kg DM的TMAO促进了底物DMD和总产气量，可能是瘤胃液中存在产生和利用甲基化合物的微生物，具有N-三甲基结构的TMAO被分解后为这些微生物提供了生长条件，从而促进了瘤胃发酵过程，由此可推测动物机体产生的TMAO随唾液返回瘤胃后也具有改善瘤胃发酵的作用。TMAO+GA组的DMD和总产气量低于TMAO组，说明GA对TMAO的分解利用产生了一定抑制作用。本试验中添加15 mg GA/kg DM抑制了底物CP降解，这与Wei等的结果一致，符合多酚类物质结合蛋白质从而减少其降解的特性。添加TMAO则提高了底物CPD，可能的原因是瘤胃中的真杆菌（）不但能以TMAO为底物产生甲基化合物实现自身生长，还可以作为一种主要的瘤胃蛋白分解菌促进底物CP的分解，但这一过程促进了蛋白质在瘤胃中的无效分解。TMAO+GA组的CPD高于对照组、低于TMAO组，可能是TMAO与GA相互作用减弱了GA对底物蛋白质的保护作用。

瘤胃发酵参数反映了添加物质对瘤胃内环境的作用效果。本研究中，添加TMAO降低了pH，提高了TVFA浓度，这与TMAO促进底物分解的结果一致，说明TMAO促进了碳水化合物的分解，VFA总量提高，pH降低。添加GA对DMD没有影响，因此，GA组的pH和TVFA浓度没有变化。根据此前分析，同时添加TMAO和GA后，GA减弱了TMAO对瘤胃发酵的促进作用，因此，TMAO+GA组的DMD和pH、TVFA浓度的结果也相符。本试验中瘤胃NH-N来源于底物CP和添加TMAO的降解，GA组低于对照组，TMAO组高于对照组，这与分别添加GA和TMAO对底物CPD的分析结果一致，TMAO+GA组的NH-N浓度低于TMAO组，与对CPD的影响一致，这也证明了TMAO促进了CP的瘤胃分解，GA则相反。虽然同时添加TMAO和GA的CPD高于对照组，部分TMAO也可能被分解产生NH-N，但是同时添加TMAO和GA的NH-N浓度与对照组无差异，这说明本组中产生的NH-N也在被消耗或利用，具体原因有待进一步研究。对于各VFA的摩尔比例，GA和TMAO影响较小，添加GA仅降低了异戊酸的摩尔比例，这与Wei等短期批次培养试验的结果一致。添加TMAO和同时添加TMAO和GA也降低了异戊酸的摩尔比例，而异戊酸主要源于部分支链氨基酸的分解，这说明GA和TMAO都可能抑制了该过程。

3.2 GA和TMAO对体外瘤胃TMA代谢的影响 Aii等研究发现，肉牛饲喂基础日粮或提供肉碱、TMAO等前体物质后2～3 h时TMA浓度达到最高水平，这与本试验中在2 h达到最高水平的结果一致。通过瘤胃瘘管投入TMAO后，TMA浓度在1 h内迅速提高，然后在3 h内基本降至添加前水平。而本试验结果表明，添加的TMAO主要在4 h时被分解完全，可能是本试验中产生的TMA不会通过瘤胃壁吸收或以气态形式溢出，只有被分解一条路径。对于累积TMA-N浓度，与对照组相比，添加GA并没有显著改变瘤胃TMA-N浓度，这说明GA对底物中含有的TMA前体物质的分解基本没有影响。对比TMAO组和TMAO+GA组的结果可知，GA在瘤胃中表现出对TMAO的保护特性，说明GA对TMAO的分解过程具有抑制作用，其原因可能是GA作为单宁类物质通过酚羟基（H-O-Ph）结合TMAO[（CH）-N-O-]形成较稳定的复合物，亦或是大肠杆菌是胃肠道中TMAO还原酶的重要来源，而GA可以被瘤胃微生物代谢分解产生邻苯三酚（1,2,3-苯三酚），后者对大肠杆菌具有抑制作用，通过减少TMAO还原酶的来源抑制了TMAO的分解，具体机制还需要进一步验证。