基于RNA-seq数据筛选鸡睾丸附睾间差异表达基因及其功能分析

赵延辉，陈 余，王 梁，吕学泽，齐晓龙，王相国，倪和民，邢 凯*，盛熙晖*，郭 勇

（1.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206；2.北京市畜牧总站，北京 100107）

睾丸及附睾的发育对雄性个体的成熟以及维持其正常生殖活动起着十分重要的调控作用。鸟类的生殖系统在脊椎动物中拥有独一无二的解剖学和生理学特征。从精原细胞分裂到形成精子的全过程称为精子生成。精子生成是一个复杂且受严格调控的过程，涉及到多种分子和信号通路以及亚细胞活动，这个发育过程需要数千个基因的顺序和协调表达，包括许多睾丸特异性基因。禽类的精子发生与其他脊椎动物精子发生过程基本相同，但是与哺乳动物的精子生成不同的是鸡的精子在离开睾丸后就获得了活力，一部分获得受精能力。在鸟类中，睾丸精子活力低，睾丸后成熟对提高精子活力十分重要，附睾在精子的成熟过程中起着重要作用，包括精子获得渐进性运动和受精能力。然而，在整个过程中，鸡睾丸和附睾发挥的作用尚不完全清楚。

基于精子生成及成熟过程的复杂，引入高通量测序技术可以更好地对睾丸附睾发挥的功能进行探究。高通量测序技术已经应用于鸡的繁殖过程中。例如，Xu等利用高通量测序技术对鸡的原始生殖细胞、精原干细胞和精子形成早期的精原细胞中的miRNA进行分析，确认候选基因与结合，参与生殖细胞的发育；Liu等对鸡睾丸组织进行转录组分析，找到和可能通过调控其潜在靶基因和发挥调节精子运动的作用。目前为止，尚未发现针对鸡附睾转录组的研究。本文利用高通量测序技术，对鸡睾丸附睾转录组进行了鉴定，并对两者之间差异表达基因进行综合分析，寻找睾丸附睾特异性相关通路。这些发现有助于深入了解精子生成及成熟机制，为研究睾丸附睾在鸡精子生成及成熟过程的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物和样品 海兰褐公鸡于北京农学院试验基地单笼饲养至45周龄，光照充足，温度适宜，食物和饮水自由。最终选取8只发育良好、精子品质优良的公鸡进行安乐死收集样本。在公鸡宰杀后立即摘取睾丸附睾样本并冷冻在液氮中，等待下一步处理。

1.2 总RNA的提取、文库制备及测序 利用Trizol试剂盒，根据说明书提取公鸡睾丸和附睾的总RNA。对总RNA的浓度、纯度与完整性进行检测，最终表明所提RNA的完整性及浓度能够满足测序建库要求。分别从每个样品中取出约1 μg RNA 按照mRNA-seq样品制备试剂盒说明，逆转录制备16个cDNA文库。根据制造商的说明（Illumina），HiSeq 2500用于双末端测序，获得原始数据。

1.3 mRNA表达分析 使用软件FastQC对测序所得原始数据进行质控，除去“N”含量10%以上和低质量的reads。将高质量的reads比对到鸡参考基因组（-6.0）。鸡基因参考数据库和基因转换文件从Ensembl genome browser下载。各样品中的每个基因的表达水平用HT-seq软件来鉴定。根据基因表达水平分析得到的数据，使用R语言edgeR包鉴定差异表达基因（FDR＜0.05和|logFC|＞1）。

1.4 差异基因的GO功能注释和KEGG通路分析 GO（Gene Ontology）功能富集分析分为三大类：生物学过程（Biological Process，BP）、细胞组成（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）数据库分析差异表达基因参与的通路。通过R包ClusterProfiler对筛选的差异表达基因进行功能富集分析，其中＜0.05的GO条目和KEGG通路被认为是显著的。

2 结果

2.1 RNA-seq数据分析 通过Hiseq 2000测序平台，对睾丸附睾样本16个cDNA文库进行了高通量测序，经质控后，每个样本平均获得3.1×10个clean reads，大约80%的clean reads被比对到鸡参考基因组。对样本的基因表达水平进行PCA分析，结果表明睾丸与附睾之间基因有明显的分离（图1A）。如图1B所示，在睾丸及附睾组内相关性很高，睾丸与附睾之间无明显差异。综上，clean reads数量和对比结果符合要求，为后面的数据分析提供了保障。

图1 样本间基因表达分析

2.2 差异基因的筛选 本研究在鸡睾丸附睾组织样本中共检测得到24 881个基因，其中1 647个在睾丸中特异性表达，349个在附睾中特异性表达。以FDR＜0.05和|logFC|＞1为筛选标准，最终得到5 124个差异表达的基因，其中2 300个基因在睾丸中高表达，2 824个基因在附睾中高表达（图2）。

图2 鸡睾丸与附睾组织中的差异基因火山图

2.3 差异基因GO注释 GO分析结果显示，睾丸组织中上调表达基因显著富集在166个生物学过程、24个细胞组成、18个分子功能中。如图3A所示，睾丸组织中上调表达基因在生物学过程上富集在解剖结构形态发生（Anatomical Structure Morphogenesis）、细胞分化（Cell Differentiation）、细胞发育过程（Cellular Developmental Process）等；在细胞组成上集中于细胞外基质（Extracellular Matrix）、含胶原蛋白的细胞外基质（Collagen-Containing Extracellular Matrix）、肌动蛋白细胞骨架（Actin Cytoskeleton）等；在分子功能上主要集中于同源蛋白质结合（Identical Protein Binding）、肌动蛋白结合（Actin Binding）、细胞骨架蛋白结合（Cytoskeletal Protein Binding）等功能。

在附睾组织中上调表达基因主要富集在51个生物学过程、26个细胞组成、44个分子功能GO条目中。如图3B所示，附睾组织中上调表达基因在生物学过程上主要集中于泛素依赖的蛋白质分解代谢过程（Ubiquitin-dependent Protein Catabolic Process）、修饰依赖性蛋白质分解代谢过程（Modification-dependent Protein Catabolic Process）等；在细胞组成上集中于核腔（Nuclear Lumen）、核质（Nucleoplasm）、染色体（Chromosome）等；在分子功能上主要集中于核苷酸结合（Nucleotide Binding）、磷酸核苷结合（Nucleoside Phosphate Binding）、嘌呤核苷三磷酸结合（Purine Ribonucleoside Triphosphate Binding）等功能。

图3 差异表达基因GO term富集分析

2.4 差异基因KEGG通路分析 睾丸组织中上调表达基因经过KEGG通路富集分析共建立了154条通路，在MAPK信号通路（MAPK Signaling Pathway）上差异表达的基因数目最多，有63个；其次为焦点粘着（Focal Adhesion）、核糖体途径（Ribosome）、肌动蛋白细胞骨架调节途径（Regulation of Actin Cytoskeleton），分别有54、51、51个（图4A）。另外，如图4B所示，附睾组织中上调表达基因经过KEGG通路富集分析共建立了150条pathway。其中，在RNA转运通路富集差异基因数目最多，有55个；之后富集基因数目较多的为泛素介导的蛋白质水解（Ubiquitin Mediated Proteolysis），为46个基因；富集到细胞周期（Cell Cycle）通路的基因有45个。通过与GO富集分析结果结合，可以对差异表达基因功能有更加全面的理解。

图4 差异表达基因KEGG通路富集分析

3 讨 论

本研究对公鸡睾丸附睾进行了转录组测序，检测到5 124个差异表达的基因，GO和KEGG分析结果表明这些差异基因在鸡的生长发育及精子生成中发挥重要作用。Słowińska等在火鸡的睾丸与附睾中找到1 682个差异表达基因，主要参与细胞周期、有丝分裂和生殖过程，包括配子的产生和发育以及精子的发生。在本研究同样注意到差异基因富集于有关细胞周期、精子生成、成熟和运动等多个方面。睾丸组织中上调表达基因在生物学过程上主要集中于细胞分化、细胞分化调控、细胞发育过程和细胞粘附过程，这可能与睾丸中原始生殖细胞分化成精子这一相关过程的调控有关。在本研究中睾丸组织上调表达基因在MAPK信号通路显著富集，研究表明此通路涉及到细胞增殖、分化和凋亡等方面，是重要的信号传导系统之一。在哺乳动物睾丸中，MAPK可以对细胞增殖、分化以及凋亡起调节作用，被认为是精子发育的重要因素之一。因此认为MAPK信号通路是调节公鸡睾丸内精子生成及精子质量保障的关键通路。本研究发现，基因在睾丸组织中上调表达，Jun等和Araujo等研究表明可以对MAPK活化起到调节作用。Das等研究表明作为AVBD家族中的一员，其含量与精子表达有关。另外Sun等研究表明的表达与精子运动能力以及精子品质有关，说明这3个基因可能是精子发生及品质保障的关键基因，其功能作用有待进一步挖掘。

精子离开睾丸后尚未获得受精能力，需要在附睾发生多种生化及生理变化，例如对精子发生过程中翻译合成的内源性蛋白质进行修饰以及加入附睾新分子等。哺乳动物精子在附睾成熟阶段有几波miRNA和tRNA被送进精子中。附睾组织中上调表达基因在生物学过程上主要集中于各种依赖性蛋白质分解代谢过程以及蛋白质修饰过程，这可能与精子成熟过程中表面蛋白质变化、精子线粒体激活及精子运动所需要的能量有关。附睾组织中上调表达基因在糖酵解途径中富集，Aitken等研究表明糖酵解途径对精子获得渐进性运动是必要的，当精子缺乏糖酵解活性时，精子由于缺乏能量而无法运动。本研究中，附睾组织中基因显著表达，TRIM36是一种泛素连接酶，介导目标蛋白的泛素化和随后的蛋白酶体降解，Aoki等研究表明TRIM36缺陷会导致精子运动能力降低以及精子品质下降。另外，泛素介导的蛋白质水解涉及到多种生理功能，参与细胞周期、DNA复制等过程。TCP11能赋予精子运动的能力，以及对于通过cAMP/蛋白激酶A途径进行精子获能起重要作用。上述结果表明基因可能在调节精子运动中起重要作用。

睾丸上调表达基因在谷胱甘肽代谢途径、细胞色素P450对外源物质的代谢作用途径、药物代谢-细胞色素P450途径明显富集。谷胱甘肽是细胞的主要抗氧化剂，并且在异种生物化合物的解毒、细胞增殖的调制、半胱氨酸的运输和储存以及氧化还原状态的维持等细胞途径也发挥重要作用。细胞色素P450酶系是重要的酶系统，能够催化环境中的药物和其他异生素（如草药和有毒化合物）的代谢。因此，公鸡睾丸在对外源药物代谢和异种生物代谢过程中可能发挥重要作用。

4 结 论

睾丸中影响精子生成的候选基因为；附睾中调节精子运动能力的关键基因为；此外，睾丸在外源物质代谢中发挥重要作用。本研究数据可以为探究睾丸附睾功能差异提供参考。