隆林山羊SMPX基因克隆及其组织表达谱分析

杨丽丽，张琼文，张 瑜，张其伟，陈 婷，江明生

（广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530000）

1999年，小肌肉蛋白（Small Muscle Protein X-Link，）在人类基因组中首次被发现，它位于Xp22号染色体上，由5个外显子和4个内含子组成，长52.1 kb，mRNA长886 bp，主要在心脏和骨骼肌中表达，初步推测与肌肉发育相关。2001年，Kemp等研究发现强运动的小鼠在引起肌细胞肥大的同时，基因的mRNA表达量显著升高，推测基因参与肌细胞增殖过程。同年，Palmer等研究发现，在CC肌细胞过表达可增强肌细胞融合。邓瑞强研究表明参与大白猪胚胎期肌纤维的发育。郭梁研究发现，基因在牦牛右心室表达量最高，因此推测基因在不同组织中发挥不同作用。官红平研究发现，基因在猪的心肌和骨骼肌中高表达，在其他组织中低表达或不表达，且基因与肌内脂肪含量呈极显著相关。上述研究表明，与肌肉发育相关，但其作用机制不清楚。因此，探究基因在肌肉发育过程中的作用可为深入研究其作用机制提供理论基础。

目前，的研究在医学领域较多，主要集中在人的听力损失上，但是关于动物肌肉发育的研究极少，仅在猪和牦牛上有过相关研究。动物肌肉的发育与肉质性状息息相关，X染色体相关小肌肉蛋白（Small Muscle Protein X-link，）基因影响肌纤维的发育，从而影响肉质性状。隆林山羊是广西地方品种，主要分布于云贵高原桂西北山区，具有极强的环境适应能力，但其生长速度慢，产肉量低，导致生产性能低，阻碍了畜牧业经济的发展。幼龄山羊生长发育速度较快，此阶段研究山羊的肌肉发育是最佳时期，因此本研究选择1月龄隆林山羊作为研究对象，对基因进行克隆，并进行生物信息学分析，同时检测其在不同组织中的表达，这将为山羊基因的进一步研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 1月龄隆林山羊3只，分别采集心、肝、脾、肺、肾、背肌、腿肌，及时处理后保存于-80℃。

1.2 主要试剂 TRlzol试剂、反转录试剂盒（Prime ScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit）、RNase Free HO、异丙醇、无水乙醇、氯仿、定量试剂盒（Prime ScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser）、Premix Taq DNA聚合酶、pMD18-T载体、大肠杆菌DH5感受态细胞均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 实验方法

1.2.1 引物设计及合成 根据NCBI查找山羊基因序列，使用oligo7.0设计、GAPDH引物（表1），送至诺唯赞生物公司合成。

表1 引物信息

1.2.2 总RNA的提取及cDNA的合成 采用TRlzol法提取1月龄隆林山羊心、肝、脾、肺、肾、背肌、腿肌的总RNA，用反转录试剂盒合成cDNA，存于-20℃备用。

1.2.3 隆林山羊基因的克隆 以cDNA为模板、为引物进行RT-PCR扩增，PCR体系：premix Taq 5.0 μL，cDNA 0.5 μL，上下游引物各0.3 μL，加RNase free HO至10 μL。以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，在紫外灯照射下用刀片切目的条带做胶回收，胶回收产物连接pMD-18t载体4℃过夜，接着转化进.DHsx感受态细胞中，37℃培养，再挑菌、涂板、菌液PCR验证，将阳性PCR扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司测序。

1.2.4 实时荧光定量PCR 用1.2.2步骤反转录合成的cDNA为模板，GAPDH为内参基因，qRT-PCR检测在不同组织中的表达量，反应体系为：premix Ex Taq II 5.0 μL，上下游引物各0.3 μL，cDNA 2.5 μL，加RNase free HO至10 μL。反应条件为：95℃预变性30 s，95℃ 变性30 s，60℃退火30 s。采用2法计算其相对表达量。

1.2.5基因克隆及生物信息学分析 MegAlign软件比对隆林山羊基因与其他物种的同源性；使用ProtParam在线软件（https://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白质理化性质；ProtScale在线软件（https://web.expasy.org/protscale/）分析疏水性；Signal 5.1在线软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测蛋白信号肽；TMHMM Server v.2.0软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测蛋白跨膜结构；NetPhos 3.1 Server软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测蛋白可能存在的磷酸化位点及保守特异蛋白激酶位点；NetNGlyc 1.0软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）预测蛋白潜在N-糖基化位点；PSORT PSORT II（http://psort.hgc.jp/）预测蛋白位置；Prabi SOPMA程序（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）预测蛋白二级结构；SWISS-MODEL软 件（http://swissmodel.expasy.org/）预测蛋白三级结构。

2 结果

2.1基因克隆 PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，观察到在400 bp处有清晰、单一的目的条带（图1），与预期结果一致。

图1 SMPX菌液PCR产物

2.2 生物信息学分析

2.2.1基因序列比对分析 隆林山羊基因CDS区与NCBI上山羊基因CDS区同源性高达100%，与绵羊、牛、野猪、人、小鼠、鸡的同源性分别是99.2%、97.6%、92.2%、91.6%、84.9%、75.7%（图2）。基于不同物种的基因核苷酸序列，利用Meg Align软件构建分子进化树（图3），系统进化树显示隆林山羊与绵羊、牛的亲缘关系比较近，与鸡的亲缘关系最远。

图2 SMPX基因同源性比对

图3 SMPX基因系统进化树

2.2.2理化性质 隆林山羊基因编码蛋白分子式是CHNOS，分子质量为20.61 ku，原子总数为2 592个，等电点5.29，说明是酸性蛋白。基因编码蛋白由4种氨基酸组成（表2），丙氨酸（Ala）占比最高为32.2%，其次是半胱氨酸（Cys），占比25.9%，甘氨酸（Gly）稍低于半胱氨酸，占25.5%，苏氨酸（Thr）最低，占16.5%，基因编码蛋白共编码255个氨基酸；消光系数4 125；不稳定系数36.09；总平均亲水性1.009。

表2 隆林山羊SMPX蛋白的氨基酸组成

2.2.3 SMPX蛋白亲/疏水性 对隆林山羊SMPX蛋白亲/疏水性预测分析，结果发现在第89位氨基酸处分值最大，为2.39，在125位氨基酸处分值最小，为0.1（图4），说明SMPX是疏水性蛋白。

图4 SMPX蛋白亲/疏水性分析

2.2.4 跨膜结构、信号肽预测及亚细胞定位 TMHMM Server v.2.0预测发现隆林山羊SMPX蛋白无跨膜结构。Signal 5.1预测发现在1～22氨基酸处SMPX具有信号肽，说明SMPX是分泌蛋白。PSORT PSORT II预测发现该蛋白定位于细胞质、内质网、细胞核、高尔基体，占比分别是33.3%、33.3%、22.2%、11.1%。综上，隆林山羊SMPX蛋白主要位于细胞质，其次是细胞核。

2.2.5 磷酸化位点、N-糖基化位点预测 预测分析该蛋白可能存在11个磷酸化位点。使用NetNGlyc 1.0在线软件，软件预测SMPX无N-糖基化位点。

2.2.6 SMPX蛋白结构预测 分析SMPX蛋白二级结构，发现螺旋结构占28.57%，转角结构占3.57%，无规则卷曲结构占66.67%，延伸占1.19%（图5）。SWISS-MODEL软件预测发现该蛋白的三级结构有2种模型（图6），且其相似度极高，第一个模型的GMQE值为0.11，无配位体；第二个模型的GMQE为0.12，无配位体。

图5 SMPX蛋白二级结构预测

图6 SMPX蛋白三级结构预测

2.3在隆林山羊各组织表达谱分析 以GAPDH为内参，qPCR检测基因在隆林山羊不同组织中的表达量，结果发现在心脏组织中表达水平最高，显著高于心、脾、肺、肾、背肌、腿肌等组织，其次在背肌中表达量高，显著高于心、脾、肺、肾、腿肌等组织的表达，在心、脾、肺、肾等组织中表达无显著性，在腿肌中表达水平最低，显著低于肝脏、脾、肾、背肌的表达（图7）。

图7 隆林山羊SMPX基因组织表达谱

3 讨 论

近几年，基因的研究领域主要在医学方面，集中于人的听力受损方面，在动物相关方面的研究极少，仅在猪和牦牛肌肉发育有过研究，且作用机制不明确。基因最早发现于人类基因组，发现在心脏和骨骼肌中表达量较高，与肌肉的生长发育有关。Beatriz等的研究表明，在人体中，基因可被肌肉调节因子调控，进而影响肌肉的生长发育。研究发现，基因在猪的心肌和骨骼肌中表达量较高，其他组织不表达或表达量低，推测基因参与猪肌肉生长发育。有研究报道，在不同时期猪背肌的表达量不同，在大白猪胚胎期60 d比胚胎期30 d、成年期大白猪表达量高14倍，与猪肌纤维的发育规律基本一致，说明基因参与大白猪肌纤维的胚胎发育。Eftestøl的研究结果揭示，在成年小鼠骨骼肌中过表达，小鼠骨骼肌纤维类型分布和横截面积上没有发生明显改变，推测在调节肌肉表型方面的作用尚不清楚。

本研究通过克隆隆林山羊基因，对基因CDS进行生物信息学分析，其基因CDS区长254 bp，编码255个氨基酸，由4种氨基酸组成。根据编码区序列比对分析结果可知，隆林山羊与山羊基因的同源性最高（100%），与鸡的同源性最低（75.7%）。根据理化性质和蛋白结构分析结果可知，隆林山羊基因无跨膜结构，具有信号肽，是分泌型蛋白，具有4个磷酸化位点；二级结构中-螺旋结构占28.57%，转角结构占3.57%，无规则卷曲结构占66.67%，延伸占1.19%。实时荧光定量qPCR检测基因在不同组织中的表达量，发现在心脏和骨骼肌表达量较高，这与Patzak和官红平的研究结果一致，基因在心肌和骨骼肌中优先表达，故推测基因参与肌肉生长发育，此推测与邓瑞强对猪的肌肉生长发育研究相符。隆林山羊属于地方品种，其产肉性能与肌肉生长发育存在紧密联系。本实验结果显示与背肌含量的表达存在一定联系，下一步可扩大数据样本进行进一步研究，该结果为研究肌肉生长发育提供了新思路。同时关于在肌肉生长发育中的调控机制不清楚，需要进一步探讨验证。

4 结 论

本研究以隆林山羊背肌cDNA为模板，成功克隆了隆林山羊的编码区，CDS序列长254 bp，编码255个氨基酸。软件预测分析表明无跨膜结构，具有信号肽，有11个磷酸化位点，亚细胞定位主要分布于细胞质。组织表达谱分析表明，在隆林山羊肝脏和背肌中表达最高，在各组织中均有表达，故推测在不同组织中发挥作用。