猪增生性肠炎实验室诊断方法研究进展

庄金秋，梅建国，姚春阳，张 颖，李 峰

（山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪增生性肠炎（Porcineproliferative enteritis,PPE）是由胞内劳森氏菌（Lawsonia intracellularis,LI）引起的一种以回肠和结肠隐窝内未成熟的肠细胞发生腺瘤样增生为特征的猪的常见接触性传染性肠道传染病。LI属于脱硫弧菌科，革兰氏阴性菌，菌体呈弧形弯曲状、逗点状或S形，是一种专性细胞内寄生菌，主要寄生在猪及其他动物的回肠、结肠、盲肠黏膜的上皮细胞内，可导致未成熟的肠道上皮细胞腺瘤样增生[1]。1931年，PPE首次在美国被发现。1993年，Lawson等首先从增生性肠病患猪的肠道分离出一种专性胞内寄生菌，建立了细菌培养方法，并用该菌的纯培养物成功复制出PPE病例。为纪念Lawson等在病原分离的贡献，1995年McOrist等将该菌命名为胞内劳森氏菌[2]。LI感染机体造成的病理损伤主要集中在肠道，根据其病理变化的不同，临床上主要表现为急性的增生性出血性肠炎（Proliferative hemorrhagic enteritis, PHE）、坏死性肠炎（Necrotic enteritis, NE）、慢性的猪肠腺瘤样病（Porcine intestinaladenomatosis, PIA）及亚临床感染等几种感染形式，其中慢性型最为常见[3]。在自然界中LI能通过多种途径传播，如鸟类、鼠、昆虫等动物性传播，人员、设备、车辆等流动性传播。易感动物很多，除可感染猪以外，还可感染马、兔、山羊、鹿、犬、狼、狐狸、大鼠、雪貂等动物[4]。LI主要感染6～20周龄生长肥育猪，病猪一般表现为被毛粗乱、食欲下降、拉稀、粪便稀软呈黄棕色，生长减缓甚至突然死亡[5]。目前该病已呈全球性流行，疾病的暴发和流行引起猪只生长发育阻滞，饲料报酬率严重降低，给养猪业造成严重的危害和巨大的经济损失，是影响世界养猪业发展的重要疾病之一[6]。近年来，国内甚至亚洲的猪场，猪增生性肠炎的发病率呈上升趋势。鉴于该病的流行性和危害性，迫切需要对其进行深入研究，而建立快速、准确、有效的诊断方法是防治该病的前提。本文综述了近年来PPE的最新实验室诊断方法研究进展，以期为疾病的防治提供参考。

1 组织病理学诊断

1.1 病理剖检

PPE的剖检病变以小肠及结肠黏膜增厚，出血或坏死为典型特征。肠黏膜增生呈现增生性花纹或分枝状皱褶，严重时似脑回状；肠管外径变粗，浆膜下和肠系膜常见水肿。增生坏死性肠段表现有臌气或炎性分泌物和积水现象，肠段较薄。坏死性肠炎的病变还可见凝固性坏死和炎性渗出物形成灰黄色干酪样物，牢固地附着在肠壁上。出血性肠病的病变类似于增生性肠病，但很少波及大肠，主要在小肠末端，表现为小肠壁局部增厚，肠腔内有血液，结肠内积有含血的粪便。局限性回肠炎的肠壁肌肉呈显著肥大，如同硬管，习惯上称“袜管肠”。打开肠腔，可见溃疡面常呈条形，毗邻的正常黏膜呈岛状[7]。根据临床症状及剖检病变仅可做出初步诊断，PPE引起的肠炎临床表现无法从肉眼上与猪圆环病毒病等引起的肠炎相区分，确诊还需要进一步的实验室诊断。

1.2 组织染色法

取PPE病例的肠黏膜、粪便等涂片或组织切片染色镜检，进行组织病理学分析，以证实是否存在LI感染。组织染色法可以用于某些时期大量样本的快速诊断。LI常用的染色法有H.E染色法、Warthin-Starry（WS）银染法、抗酸染色法、萋-尼氏（Ziehl Neelsen）染色法等[8]。肖爱欢等（2009）[9]取猪回肠等组织固定后，制作石蜡切片，H.E染色，在显微镜下观察到在回肠处有丰富的集合淋巴小结，且该部位腺窝杯状细胞消失，上皮细胞增生。镀银染色法可检测到组织中弯曲样细菌，但对于自溶和坏死样品具有限制性且无特定性。罗玲等（2008）[10]报道，将病变增生性肠段做成切片，经镀银染色法后，在上皮细胞的顶部胞浆中观察到有大量的LI。LI革兰氏染色阴性，抗酸染色阳性，Ziehl Neelsen染色呈红色。组织染色法具有快速、简便等特点，但其不足之处是特异性较差，特别是对镜检未见黏膜增生性变化的病例及坏死的或自溶组织样品时存在明显的非特异性。

1.3 免疫组化法（IHC）

IHC是应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原（多肽或蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。Gebhart等（1991）[11]使用特殊标记的1.8 kb特异性DNA片断，进行回肠段冰冻组织中胞内劳森氏菌的免疫组织化学诊断。Kim等（2000）[12]首次用抗LI膜蛋白单抗建立免疫组化法，检测增生性肠上皮细胞胞质顶端是否存在LI，并与PCR鉴定结果进行比较。田城（2012）[13]在被LI感染的大鼠回肠上皮细胞（IEC-18）中，经过免疫组织化学法，观察到胞浆中有特异性染色的弯曲样杆菌。其中一抗为鼠抗LI单克隆抗体，二抗为生物素标记的山羊抗小鼠IgG。Guedes等（2003）[14]比较了PPE的不同诊断方法，结果表明，对于PPE病例组织中LI的检测，IHC染色的敏感性（86.3%）高于H.E染色（36.8%）及WS染色（50%），IHC检测结果与PPE感染后4周的肉眼观察结果有很高的相关性（82.5%），认为IHC是最好的福尔马林固定样品诊断方法。IHC可从黏膜已完全破坏的病例中检测出LI，也可检出康复阶段只有黏膜固有层单核细胞存在的LI。

2 细菌分离与鉴定

LI的分离培养是PPE诊断的金标准。由于LI是一种专性胞内寄生菌，目前尚不能用常规细菌培养方法培养，也不适应鸡胚增殖，但其可在某些特定的细胞内进行体外分离和培养。适于LI生长的细胞系有IEC-18、猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）、人小肠上皮细胞（INT 407、Henle407）、鼠结肠癌细胞、豚鼠结肠癌细胞（GPC-16）以及小鼠成纤维细胞（McCoy）等。由于该菌具有细胞依赖性呼吸作用和磷酸盐制造能力，因此在细胞培养中需要维持微需氧环境（4%～10%的二氧化碳和0～10%的氧气），并且要加入一定的抗生素以防止其他细菌的生长。感染的细胞单层一般不出现细胞病变。Lawson等（1993）[15]利用处理过的感染猪的回肠匀浆感染IEC-18细胞，在82.8%氮气、8.8%二氧化碳、8%氧气环境中成功分离到该菌。Koyama等（2006）[16]对日本分离株进行体外培养，用肠黏膜提取物接种IEC-18细胞和Hep-2细胞，接种5 d后，用兔抗LI抗体染色，观察到LI，其培养液中LI的浓度为104个/mL。LI因其特殊的培养条件，目前世界上分离到的菌株十分有限，国内也未见有经细胞成功分离出LI的报道，给该菌致病机理和防控技术等研究造成了很大障碍，限制了研究的深入。

3 血清学检测方法

3.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA具有操作简便、灵敏准确、经济适用等优点，可用于大批量LI感染或疫苗免疫后血清抗体样本的检测，被广泛用于PPE的诊断和猪场流行病学调查。目前用于LI检测的ELISA方法主要是间接 ELISA方法，选取的包被抗原有全菌、脂多糖（LPS）、脱氧胆酸盐（DOC）、Lsa A蛋白、LI外膜蛋白、重组鞭毛钩基体复合蛋白（flgE）等[17]，已有多种商品化的ELISA检测试剂盒。Holyoake等（1994）[18]以LI离心沉淀后的全菌作包被抗原建立间接ELISA方法。Watarai等（2004）[19]以LI Lsa A蛋白为包被抗原建立间接ELISA方法。Kroll等（2005）[20]用LI毒株纯培养物提取的LPS作为包被抗原建立LPS- ELISA方法。与IFA（间接免疫荧光抗体试验）相比，LPS包被的ELISA可检测出更多的IgG，其敏感性（99.5%）及特异性（100%）比IFA高，可用于LI感染的早期检测，其结果不受细菌分离株（疫苗株或野毒株）差异的影响。Boesen等（2005）[21]以LI脱氧胆酸盐为包被抗原建立DOC-ELISA方法，该方法的特异性（99.3%）及敏感性（98%）与LPS包被的间接ELISA相似，而高于IFA及IPMA（免疫过氧化物酶细胞单层试验）。黄忠等（2006）[22]对采自福建、广东、广西、湖南、湖北5省区22个规模化猪场的1 100份血清样品进行了ELISA检测，结果显示，22个猪场均有LI感染，其中18～24周龄的猪阳性率高达90%，后备母猪和母猪阳性率高达50%～100%，10周龄以下猪的阳性率一般低于50%。Wattanaphansak等（2008）[23]以超声处理的LI纯培养物作为包被抗原建立ELISA方法，能检测到LI感染后2～4周的转化血清，灵敏度为89.8%，特异性为99.4%。蒋增艳等（2008）[24]采用ELISA方法对国内LI感染情况和流行情况进行调查，结果发现所有受检猪场LI抗体均为阳性，其中受检猪场中肥育猪阳性率为99%。张曙俭（2012）[25]、刘磊（2013）[26]先后以LI外膜蛋白1102、1024建立间接ELISA方法。吴艳阳等（2018）[27]以纯化后的LI Lsa A蛋白为包被抗原建立间接ELISA方法。廖荣莉等（2021）[28]以纯化的LI重组鞭毛钩基体复合蛋白flgE为包被抗原建立间接ELISA方法。结果显示，母猪和肥育猪的感染率高达100%；母源抗体下降后，自50日龄起到肥育猪阶段，LI阳性率和抗体水平随着日龄的增长而不断上升。ELISA检测方法具有较强的特异性和较高的敏感性，可用于大批量样本检测，节省人力和物力，但是也有一定的缺点，如不同批次存在一定差异，操作环节较多，存在很多影响因素等。

3.2 间接免疫荧光抗体试验（IFA）

IFA可用已知抗原检测未知抗体，也可用已知抗体检测未知抗原，具有灵敏度较高、特异性较强的优点。Lawson等（1988）[29]用IFA试验对人工感染 LI的猪进行抗体检测，结果表明早期出现的抗体主要是IgM，其次为IgA。Knittel等（1998）[30]用纯化的LI培养物作抗原，猪血清为第一抗体，FITC标记的抗猪IgG抗体为第二抗体，以此改进IFA，可检测到LI的IgG抗体。其在评估PCR和IFA检测LI感染情况时，发现在感染21～28 d，PCR检出率为39%，IFA检出率为90%，且在猪死前检测IFA方法敏感性远高于PCR检测。Tomanova等（2003）[31]用IFA检测抗LI-IgG抗体时发现，IFA可用于活体中LI的检测。Huerta等[32]（2003）设计了一组双盲试验，比较PCR与IFA、剖检、H.E染色后组织病理学观察和Warthin-Starry银染4种方法在PPE诊断中的效果。发现IFA的灵敏度为89%、特异性为97%，与PCR检测结果的符合率为82%，可以作为猪宰后PPE诊断的一种替代方法。陈长风（2019）[33]通过表达LI热休克蛋白（Hsp60）重组蛋白，利用制备的单克隆抗体9G作为一抗，使用FITC标记的羊抗鼠抗体作为二抗，建立了IFA检测方法，灵敏度高达102个菌/mL。使用该法检测了25份临床样品，与PCR方法符合率为100%。IFA具有较高的特异性和敏感性，但也存在一定的缺点，如操作和仪器要求较高，存在非特异性染色造成结果的假阳性，在结果观察时存在较大的人为主观性等。

3.3 免疫过氧化物酶细胞单层试验（IPMA）

IPMA是一种血清学免疫酶测定试验，可用于猪感染 LI后血清抗体检测，敏感性与IFA法相当。与IFA相比，IPMA不需要荧光显微镜，并且着色后的微孔板可以稳定保存数月，可为诊断提供更为直观的证据。Guedes等（2002）[34]应用IPMA和IFA两种方法进行平行试验，比较人工口服接种LI感染的肠黏膜匀浆，检测感染后7 d、14 d、21 d、28 d的抗体水平，结果表明两种方法检测结果符合率为98.6%。Corzo等（2005）[35]收集29个猪场的523份血清，与培养有LI的单层细胞96孔板（已用丙酮和甲醇固定）进行反应，再加入抗猪 IgG 酶标抗体与血清中特异性抗体结合，染色后于倒置显微镜下观察细胞染色结果。该报道还与IFA进行了比较，评价两者在检测自然感染猪血清样本时的准确度和一致性。结果认为，IFA的假阴性较多，而IPMA假阳性较多。IPMA可用于生前检测，但存在一定的不足，如其操作技术要求高、成本高、假阳性高，不适合大批量样品检测等。

3.4 电子探针分析技术（EPMA）

李磊（2014）[36]探索并建立了LI的EPMA抗体检测方法，摸索了该方法的最佳HRP-Protein A工作浓度为1∶2 000，最佳孵育时间为1 h，底物显色最佳时间为15 min。该方法特异性好、敏感化强、操作流程方便，适用于LI抗体的检测，为PPE疫苗免疫效果的评价、流行病学调查及相关检疫提供了一种新的技术手段。

4 分子生物学检测方法

4.1 PCR

PCR技术具有快速、敏感、特异等优点，是目前作为检测粪便和肠内容物中LI的金标方法。可用棉拭子从猪肛门采样或采集新鲜粪便样品，也可用于感染猪死后病理材料的检测。PCR方法通常根据LI菌染色体DNA或16S rRNA部分基因片段设计引物，通过PCR或套式 PCR（nest-PCR）扩增相应基因片段，电泳后判定结果。PCR方法其灵敏度高于病理剖检、组织染色、免疫组化、细胞接种培养等方法，其检测样本需要量小、操作相对简便、耗时短、特异性高。

Jones等（1993）[37]和McCormick等（1995）[38]根据LI的16S rRNA基因序列设计引物建立PCR法，可从感染猪肠黏膜中检测出10个LI纯培养物或从每克粪样中检测出1 000个LI。Jensen等（1997）[39]将65份肉眼判断为PPE感染的肠道病料，用Warthin-Starry法镀银染色，检出阳性62份（95%）；用IHC染色，检出阳性64份（98%）；以PCR法检测，检出阳性63份（97%）。说明这3种方法，包括有经验的肉眼判断，均有相当的可靠性。对22份肉眼认为疑似PPE的病料，用PCR法检出阳性的有17份（77%），用IHC检出阳性的有14份（64%），PCR检出率较高。Jodan等（1999）[40]认为，PCR最敏感，IFA次之，Warthin-Starry镀银染色法再其次。Suh等（2000）[41]根据LI的210 bp基因片段建立了一步法PCR，其中肠黏膜检出率达94%，粪便样本检出率达88%，样本检测的敏感性可达100 pg。Jacobson等[42]（2003）使用了一种模拟DNA（mimic DNA），以证实粪便样品中是否存在抑制因子，该DNA在PCR反应体系中能被LI特异性引物扩增。张曙俭（2012）[25]、郭建超等（2014）[43]、孙娜等（2017）[44]先后根据16S rRNA基因设计引物建立了PCR方法。董炳梅等（2011）[45]通过扩增天冬氨酸蛋白酶（aspA）基因建立PCR方法，阳性样品最低检出量为1.7×102拷贝/μL。

套式PCR与普通PCR相比，特异性更强，敏感性更高。Moller等（1998）[46]、Dongkyun等（2000）[47]先后建立套氏PCR方法，检测LI、致病性沙门氏菌和猪痢疾螺旋体3种病原体。Jacobson等（2003）[42]使用7种不同粪便前处理方法和4种不同DNA聚合酶进行PCR或套式PCR。发现PCR检测组织样品的灵敏度可达10～100个菌/管，套式PCR检测粪便样品的灵敏度可达100～1 000个菌/管。Joanna等（2004）[48]应用套式PCR和IFA法检测LI，从波兰各地采集了364份非感染猪回肠和结肠肠样及364份血清，应用套式PCR法检测出阳性样品194份，IFA检测阳性样品322份，结果显示，套式PCR适合LI早期诊断。张文波等（2014）[49]、彭忠等（2017）[50]先后建立检测猪LI的套氏PCR方法并验证该方法具有快速、方便和敏感性高等优点。La等（2006）[51]建立检测LI、猪痢疾短螺旋体、多毛结肠短螺旋体的多重PCR方法，检测192份粪便样本，分别扩增655 bp、354 bp和823 bp片段，检测灵敏度最低为每克粪便样本中102～103个LI。王恒（2020）[52]建立多重PCR方法检测LI、猪痢疾短螺旋体、艰难梭菌3种病原，其中LI选取asp A基因。

纳米金 PCR（Nanogold-assisted PCR）是近年来发展起来的新型技术，它是在普通PCR基础上添加纳米金颗粒，使纳米金材料对普通PCR原有体系进行调控，进一步优化反应体系，提高反应的灵敏度和特异性。白云等（2016）[53]根据LI 16S rRNA基因序列设计引物建立了纳米金PCR方法，结果表明该方法检测灵敏度比普通PCR高100倍，适用于LI的临床快速检测与流行病学调查。

PCR方法的建立与应用为PPE的疫病诊断及流行病学、传播途径的研究提供了快速、简便和有用的工具。但是该方法也存在一定的不足：一是基因的选取，尽量选取保守区基因；二是引物非特异性，引起假阳性和假阴性结果；三是该方法的检测结果受排菌期的影响；四是粪便样本中PCR抑制因子的影响。Jordan等（1999）[40]认为隐性携菌但不排菌时无法鉴定PPE，由于在亚临床或慢性感染的病例中，间歇排菌比较常见，因此用PCR检测粪样时可能造成假阴性。

4.2 荧光定量PCR

实时荧光定量PCR与PCR相比，具有定量、更高的特异性和灵敏度等优点。目前实时荧光定量PCR方法主要是SYBR Green I染料法和探针法，前者操作简单，成本低；后者特异性更高强，假阳性率较低。Wattanaphansak等（2008）[23]根据LI的asp A基因设计引物，成功建立SYBR Green I实时荧光定量PCR方法，定量检测田间样品中的LI。马景霞等（2015）[54]根据LI基因组asp A序列设计引物建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法，灵敏度为17.5拷贝/μL。郑新添等（2015）[55]根据LI 16S rRNA序列设计引物建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法，最小可检测到10拷贝/μL的重组质粒。该方法对粪便及小肠组织中LI的检出率分别为46.9%和84.2%，高于普通PCR的检出率（分别为40.7%和78.9%）。Lindecrona等（2002）[56]根据LI 16S rRNA基因序列设计引物和探针，建立了TaqMan荧光定量PCR方法，在204个临床样品中，有111个样品（54%）检测为LI阳性，而用IHC法检测只有98个样品为阳性（48%），其检测灵敏度超过免疫组化法。Richter等（2010）[57]根据LI 16S rRNA建立的TaqMan探针法实时荧光定量PCR，用于检测猪粪便和肠道内LI，在肠黏膜刮取物最低能检测到DNA量达4拷贝/管，在粪便和组织最低能检测到DNA量达18拷贝/管。田城（2012）[13]根据LI 16S rDNA保守序列设计引物和探针建立TaqMan荧光定量PCR方法，利用该方法对173份临床样本进行检测，检测结果与套式PCR基本一致，符合程度较高。陈世界等（2013）[58]根据LI asp A基因序列设计引物和探针建立的TaqMan荧光定量PCR，其敏感性高于套式PCR方法。郑新添等（2014）[59]、白挨泉等（2014）[60]根据LI 16S rRNA序列设计引物和探针建立的TaqMan荧光定量PCR，对猪粪便样品中LI进行定量检测，最低检出量分别为10拷贝/μL和5.55拷贝/μL。荧光定量PCR方法适用于大量样本的检测，为LI的早期快速定性检测和定量分析以及PPE的致病机理研究提供了技术支持，也为PPE分子诊断试剂盒的研制奠定了技术基础。但是由于本方法操作严谨、灵敏度高、容易出现气溶胶污染，造成定量结果的不准确性。另外本方法需要精密仪器和专业人士操作，也是局限之一。

4.3 环介导等温扩增技术（LAMP）

LAMP技术为一种新型、快速基因扩增方法，能在恒温（60～65 ℃）条件下，短时间（通常是1 h）内进行核酸扩增，具有快速、敏感、特异、简单等优点。Park等（2015）[61]、罗露（2015）[62]、Li等（2018）[63]先后成功建立快速检测猪粪便样本中LI的LAMP方法，敏感性为普通PCR的100倍。LAMP不仅可以在实验室短时间操作完成，也能在现场操作，而且不需要繁琐的操作步骤和实验室精密的仪器，通过肉眼便可直接观察。但是，该技术由于灵敏度较高，容易受气溶胶污染影响结果。另外该方法需要多对引物，容易造成引物之间的非特异性结合而影响结果。

4.4 重组酶聚合酶扩增技术（RPA）

RPA是一种近年来被广泛应用的等温核酸扩增技术，具有快速、简单、特异性强、灵敏度高等优点，目前已经被广泛应用于不同领域不同病原的快速检测。Wu等（2019）[64]建立了检测LI的RPA方法，该方法在25～40 ℃下，30 min即可完成，不需要借助电泳，通过肉眼直接观察结果，并且其结果与PCR检测结果一致。刘立兵等（2020）[65]根据LI菌16S rRNA基因序列设计引物和Exo探针建立了RPA方法。该方法能够在39 ℃恒温条件下，20 min内实现对LI的有效检测，并且结果同LAMP和荧光定量PCR方法一致。RPA技术的缺点是反应条件要求较高，且需要最适的酶反应条件。

4.5 原位杂交（ISH）

Jones等（1993）[66]利用地高辛标记的1.8 kb的LI特异性探针从病猪粪便中检测LI基因组DNA，其所建立的核酸探针杂交法的检测极限为每克粪便中有107个LI。Gebhart等（1994）[67]用一种与16S rRNA的高变区序列互补的寡核苷酸探针成功地与LI进行了杂交，建立了精确检测LI的DNA探针分析法。Boye等（1998）[68]建立一种检测LI的荧光16S rRNA原位杂交方法，荧光探针能与16S rRNA基因序列结合。Weissenbock等（2007）[69]以地高辛标记的LI的16S rRNA序列为探针对福尔马林固定的组织切片进行原位杂交，对PCR阳性的PPE样品进行检测，结果原位杂交阳性率为71%，其敏感性高于WS银染法（阳性率为41%）。ISH法耗时费力，且操作需要经过培训的专业技术人员，因此在PPE亚临床感染的诊断、流行病学和群体监测中应用较少。

4.6 PCR-酶联寡核苷酸探针捕获法

Zhang等（2000）[70]采用PCR-酶联寡核苷酸探针捕获法替代PCR扩增后的琼脂糖电泳和EB染色。该方法使用的微孔板上固定有胺修饰的DNA捕获探针，PCR扩增产物（生物素标记）可以与其杂交，形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，通过测定450 nm时的吸光度值可以反映出产物量的真实变化。此方法可以检测到0.8 ng的DNA，而EB染色仅能检测到6.1 ng。应用该法对315份临床样品进行检测，其特异性为100%、灵敏度为74%、准确率为94%。

5 小结

胞内劳森氏菌是一种重要的肠道致病菌，虽然该菌引起的猪增生性肠炎主要表现为亚临床症状，很少引起猪群的大批死亡[71]，但是由于该菌常与其他多种肠道病原混合感染，已经严重影响猪只的日增重和饲料转化率，给养猪业造成了很大的经济损失。随着我国集约化养猪业的发展，LI在全国范围内不同猪场抗体阳性率的不断增加，提示养猪业应提高对LI感染的重视度，加强血清学监测，及早采取有效措施控制LI感染在我国的发生和流行。一种特异、灵敏、操作方便且快速检测LI的检测方法，对猪群中PPE的监测、预防、控制和清除具有重要意义。上述PPE的诊断方法多种多样，技术在不断的革新和完善，但是每种方法均具有各自的优缺点和实用性，在实际应用中应根据具体情况选择适宜的方法。目前国内对PPE临床感染情况的相关研究报道仍然很少，相信随着人们对LI相关基因结构和功能的深入研究及对菌株与宿主间相互作用机制的正确认识，PPE的各种诊断方法将会得到进一步改进和完善，向着更加敏感、特异、快速、简便、高效的方向发展，并在综合防控与净化中发挥重要作用，从而达到根除疾病的目的。