猪消化道对不同工艺替米考星预混剂的吸收利用评价试验

Keanpen刘继根赵易艺温华鑫罗 昌

（1道勤生物科学 （美国）；2长沙道勤生物科技有限公司，湖南长沙 410125）

替米考星是一种新型的半合成大环内酯类广谱抗菌药，对巴氏杆菌属、支原体和各种革兰氏阳性菌具有活性[1]。因其在体内分布广、半衰期长、肺部高蓄积等特点，主要用于牛、山羊、猪、鸡等动物呼吸系统疾病的临床治疗[2]，在猪的生产应用中，替米考星对胸膜肺炎以及乳腺炎具有良好的治疗效果[3,4]，并能有效预防和治疗呼吸道疾病[5-7]。替米考星预混剂已被开发为一种药物饲料添加剂，用于控制由放线杆菌引起的细菌性肺炎[8]。但替米考星不耐酸，而且本身味道苦，适口性差，不仅对胃机能有损伤，在胃液作用下其药效也大大降低[9,10]。为了改善传统剂型的不足，本试验探究“星月工艺（通过特殊辅料和载体进行包被，使替米考星在胃内环境表面成膜，保护胃壁的同时防止药效被胃酸破坏，在肠道内相对碱性条件及酶的作用下释放吸收发挥作用）”包被的替米考星与普通不水溶产品、普通水溶产品、普通包被替米考星在猪体内的药物代谢动力学特性，通过观察猪的采食情况以及猪血液中替米考星的浓度变化，探讨不同加工工艺替米考星预混剂对猪只消化道吸收利用率的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

高效液相色谱仪：SHIMADZU LC-16，紫外检测器：SHIMADZU SPD-16，均购自岛津仪器（上海）有限公司；C18色谱柱：ETA-16C（4.6 mm×250 mm，5 μm）；高速冷冻离心机：TGL-16，长沙湘仪仪器有限公司；酸度计：PHS-3C，上海仪电科学仪器股份有限公司；组织匀浆机HM 6300，莱普（北京）科技有限公司；水浴氮吹仪：UGC-24M，北京优晟联合科技有限公司；电子天平：SHIMADZU AUW120D，岛津仪器（日本）有限公司；涡旋混合器：XW-30S，上海仪昕科学仪器有限公司；可调微量移液枪：Eppendorf。

1.2 药品和试剂

1.2.1 主要药品标准品

替米考星标准品（CAS：k0311805，规格100 mg，含量93.9%）购自中国兽医药品监察所。

1.2.2 供试样品

替米考星预混剂（“星月制剂”产品） （A组）、替米考星预混剂1（普通不水溶产品） （B组）、替米考星预混剂2（普通水溶产品） （C组）、替米考星预混剂3（普通包被产品） （D组）均购自市面上在售产品。

1.2.3 试验试剂

二正丁胺（分析级），磷酸（分析级），乙酸铵（分析级）购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈（色谱级），甲醇（色谱级），四氢呋喃（色谱级），购自天津市光复科技发展有限公司。

1.3 溶液配制

替米考星储备液（1 mg/mL）：称取50 mg替米考星对照品于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，4℃避光保存。使用时配成不同浓度的标准工作液。

二丁胺磷酸缓冲液（1 mol/L）：取10%磷酸溶液700 mL加到168 mL二丁胺中，边加边搅拌，待溶液冷却至室温后用磷酸调节pH值至2.5，加水定容至1000mL，过滤备用。

流动相：将700 mL水加入1 000 mL容量瓶中，分别量取真空脱气后的乙腈130 mL、四氢呋喃55 mL、1 mol/L二丁胺磷酸缓冲液25 mL加入水中，定容至1 000 mL，用0.2 μm滤膜过滤。使用时注意密封。

2 分析方法

2.1 试验动物的饲养与管理

选择健康、体重相近的三元杂商品猪20头（40.0±1.5 kg），公母各半，随机分成5组，每组4头，分别为空白对照组、“星月技术”替米考星A组、替米考星普通不水溶产品B组、替米考星普通水溶产品C组、替米考星包被产品D组。试验组在基础饲料基础上分别添加为20 mg/kg（以替米考星计）的不同制剂的替米考星预混剂。试验猪在给药前3 d饲喂不含任何药物的基础日粮，自由饮水。在饲喂替米考星预混剂之前10～12 h禁止饲喂。

试验开始后，观察猪只的采食情况，记录给料量，收集剩料并称重，比较不同替米考星组猪的采食量。服药后分别于15 min、30 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h 等时间点对试验猪进行前腔静脉采血，每次采血5 mL置于采血管中，4 000 r/min离心10 min，吸取上清血浆，－20℃冻存待测。

2.2 样品处理

取血浆样品0.5mL置于2mL离心管中，添入1mL乙腈，涡旋混合2 min，12 000 r/min离心15 min后将上清液移至试管中，将其用氮吹仪40℃吹至干燥，取出试管，加入0.5 mL流动相使其溶解，涡旋混合2 min后倒入离心管中12 000 r/min离心15 min，0.22 μm有机滤膜过滤供HPLC分析，进样量为20 μL。

2.3 仪器条件

2.3.1 色谱条件

流动相：水∶乙腈∶磷酸二丁胺∶四氢呋喃体积比为790∶130∶25∶55；检测波长：290 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min。

2.3.2 标准工作曲线

用流动相将储备液稀释成0.025 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL 的标准工作溶液，按照样品处理方法处理，取20 μL进行HPLC测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到线性回归方程和相关系数。

3 结果与分析

3.1 不同工艺对猪采食量的影响

由图1可看出，替米考星预混剂A、D处理组与空白饲料组采食量较高，且3组之间差异不显著（P＞0.05）；替米考星预混剂B、C组与空白饲料组比较，采食量分别下降了16.86%和14.70%。通过日常观察，替米考星预混剂B、C组相比于替米考星预混剂A、D组以及对照组，采食速度明显较慢，说明替米考星可溶性和不可溶性预混剂对猪的适口性有影响。

图1 不同工艺对猪采食量的影响

3.2 血浆中的药物浓度

猪服用不同工艺的替米考星预混剂后，不同时间点的血药浓度见表1，替米考星预混剂A组在猪的血液中随着给药时间缓慢释放，在给药3 h血药浓度达到峰值，且有显著高于替米考星预混剂B、C、D组（P＜0.05）；而替米考星预混剂C、D组的血药峰值在给药后1.5 h，但峰值的数值为0.84～0.86 μg/mL之间，也显著低于替米考星预混剂A组的1.19 μg/mL的峰值（P＜0.05）。4种替米考星预混剂在猪体内的血药浓度均在给药72 h后降至0。健康猪采食不同工艺替米考星预混剂后，替米考星在健康猪体内的血药浓度—时间曲线图分别见图2，替米考星预混剂A组在猪体内的血药浓度峰值显著高于其他组。

表1 口服替米考星预混剂后的替米考星在猪体内的平均血药浓度 （μg/mL）

图2 不同工艺替米考星预混剂在猪体内的血药浓度—时间曲线图

3.3 药代动力学参数

选用winnonlin 5.2.1药物代谢动力学软件处理分析不同工艺替米考星预混剂在猪体内的血药浓度数据，主要药动学参数见表2。非房室模型分析发现替米考星A组预混剂药物浓度达峰实测值Tmax为3.95h，Cmax为1.22 μg/mL，相比较其他3个处理，达峰时间最晚；其药物平均驻留时间为22.15±2.96 h，药物消除半衰期 t1/2为 15.66±0.93 h，均大于其他3种工艺替米考星预混剂产品，说明替米考星A组预混剂的制剂工艺使药物具有缓释作用，替米考星A组预混剂在猪体内的药物半衰期长，血中药物浓度高，维持时间长，吸收稍慢但相对充分，相对生物利用度高。

表2 不同工艺替米考星在猪体内的药动学参数

4 总结

饲喂替米考星A组预混剂产品后猪表现为采食量正常，说明A组预混剂的制剂工艺其掩盖了药物本身的苦味，改善了药品的适口性；并且具有较好的缓释吸收效果，减轻了药物对胃的刺激和胃酸对药效的影响，替米考星A组预混剂相较于B组、C组、D组产品，其血药浓度较高，说明该工艺有效地提高了药物生物利用度，在临床使用中具有很强的优势，对降低成本、提高药效、避免耐药性具有长远的意义。