新化合物130P4对迟发性运动障碍的作用

刘如梦,徐亚男,朱晓音,田京伟

(烟台大学药学院,分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学),新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心,山东 烟台 264005)

迟发性运动障碍(Tardive Dyskinesia,TD)是一种以面部、躯干或身体其他部位异常的不自主重复运动为典型特征的疾病,口服抗精神病药物发病率约为20 %～40 %,口服长效抗精神病药物约为50 %[1]。TD的具体发病机制尚不清楚,但目前被公认的发病理论是“D2受体增敏”,即突触后D2受体长期被药物阻滞导致其对多巴胺的敏感性上调,黑质-纹状体多巴胺直接通路与间接通路失衡,从而表现出不自主重复运动[2-3]。

TD严重影响患者的生活质量,数十年来,临床医生广泛使用非适应症药物治疗TD。2017年,美国FDA批准囊泡单胺转运蛋白2(Vesicular Monoamine Transporters 2,VMAT2)抑制剂缬苯那嗪(Valbenazine,VBZ)用于TD治疗,此后作为TD治疗的一线用药[4]。VMAT2主要表达于中枢单胺能神经元的突触囊泡膜上,利用囊泡膜上的H+-ATPase所产生电化学梯度驱动单胺类递质转运至突触囊泡内储存以备释放。VBZ及其活性代谢产物羟基丁苯那嗪(Dihydrotetrabenazine,DHTBZ)与VMAT2可逆结合,阻止多巴胺被转运至突触囊泡,减少多巴胺的释放,使黑质-纹状体多巴胺直接通路与间接通路恢复平衡,从而治疗TD相关症状[5]。在前期研究中,VBZ能够降低大鼠自主活动,诱导大鼠眼睑下垂,升高血清催乳素浓度,这些改变都与单胺类递质释放减少相关,通过动物模型可评价其治疗TD的作用。

本课题组在DHTBZ的结构基础上进行改造,合成了新化合物130P4,化学结构如图1所示[6]。本研究通过对化合物与靶点VMAT2的亲和力检测、大鼠自主活动模型、眼睑下垂模型和催乳素升高模型,考察130P4的药效作用。

图1 130P4的结构式Fig.1 The structure of 130P4

1 实验部分

1.1 实验动物与药品

动物:实验所用Sprague-Dawley(SD)大鼠(雄性,200～220 g)购于济南朋悦实验动物繁育有限公司。大鼠饲养于无特定病原体(SPF)标准动物房,温度21±2 ℃,湿度40 %～70 %,昼夜12 h交替,提供充足的食物和水,动物于实验开始前在动物房至少预适应一周。所有实验均按照中华人民共和国卫生部和中国医科大学动物保健委员会的指导原则进行,研究方案经烟台大学实验动物研究委员会批准。

药品:130P4(MW: 387.55)由山东绿叶制药有限公司提供,VBZ对甲苯磺酸盐(MW: 762.97)购于江苏维凯尔医药科技有限公司,二甲基亚砜购于阿拉丁试剂,Kolliphor®HS 15(别名Solutol®HS 15)购于Sigma, RayBio Rat Prolactin ELISA Kit 购于RayBiotech。

分组及给药:SD大鼠随机分组,每组8只。供试药物先由适量分析纯二甲基亚砜溶解后,再加入20 %的Solutol®HS 15溶解至所需药物浓度,药物溶液中二甲基亚砜的浓度为2 %。灌胃给药,在给药后不同时间点进行实验。

1.2 实验方法

1.2.1 放射性配体受体竞争结合实验 130P4对VMAT2亲和力检测,采用差速离心法制备雄性SD大鼠大脑(不含小脑)富含VMAT2的膜蛋白。取32 μg膜蛋白与10 nmol/L [3H]-DHTBZ及0.32～ 32 nmol/L的130P4在25 ℃孵育30 min。过滤和清洗膜蛋白,然后对膜蛋白进行检测[7]。

1.2.2 自主活动实验 (1)剂量效应关系研究:SD大鼠随机分为8组:对照组,2.5、5.0和10 μmol/kg VBZ组,1.25、2.5、5.0和10 μmol/kg 130P4组,检测单次给药后0～1 h内各组大鼠自主活动总运动距离[8]。(2)时间效应关系研究:SD大鼠随机分为3组:对照组,5.0 μmol/kg VBZ组和5.0 μmol/kg 130P4组,检测单次给药后0～1 h、1～2 h、2～3 h、4～5 h、7～8 h内各组大鼠自主活动总运动距离,计算总运动距离减少率。总运动距离减少率=(对照组大鼠总运动距离-给药组大鼠总运动距离)/对照组大鼠总运动距离×100 %。

实验前一天将大鼠置于活动室适应10 min,实验当天先将大鼠置于测试实验室中适应环境1 h,然后将大鼠放入活动室,使用TopScan监测系统记录并分析大鼠在活动室内的总运动距离。每组实验结束后,使用75 %的酒精将粪便清洗干净以避免气味等因素对大鼠运动活动造成影响。

1.2.3 眼睑下垂 SD大鼠随机分为5组,分别为:对照组,2.5、5.0 μmol/kg VBZ组,2.5、5.0 μmol/kg 130P4组。分别在单次给药后第1、2、4、8小时对大鼠进行眼睑下垂评分,每个时间点的观察时间为3 min,观察开始前轻轻提起大鼠尾巴使其前爪离开桌面后再轻轻放下,以排除大鼠休息或睡眠行为对药理性眼睑下垂的干扰。对每分钟内的眼睑下垂进行评分,取观察期内3个评分的平均值。评分标准:0=眼睛完全睁开;0.5=上眼睑下垂1/4;1=上眼睑下垂1/2;1.5=上眼睑下垂3/4;2=眼睛完全闭合[7, 9]。

1.2.4 催乳素分泌 SD大鼠随机分为3组,分别为:对照组、5.0 μmol/kg VBZ组和5.0 μmol/kg 130P4组。在给药后60 min采用眼内眦法取血,室温放置2 h,在转速3800×g、4 ℃条件下离心15 min,取血清于-80 ℃储存以备用。采用酶联免疫吸附实验检测血清中催乳素浓度[7]。

1.3 统计学方法

2 实验结果

2.1 130P4与靶点VMAT2亲和力检测

实验结果如表1所示,130P4与大鼠脑组织VMAT2亲和力高,其亲和力高于阳性对照化合物DHTBZ。

表1 130P4与VMAT2亲和力检测结果Tab.1 Result of VMAT2-binding affinity of 130P4

2.2 130P4对大鼠自主活动影响的剂量效应关系

实验结果如图2所示,与对照组大鼠相比,VBZ各组大鼠的自主活动运动距离均降低,其中5.0 μmol/kg组和10.0 μmol/kg VBZ组大鼠运动距离与对照组相比差异有统计学意义(P< 0.05)。130P4各组大鼠自主活动运动距离均降低,其中2.5 μmol/kg组、5.0 μmol/kg组及10.0 μmol/kg 130P4组大鼠运动距离与对照组相比差异有统计学意义(P< 0.05)。给药剂量在2.5 μmol/kg～10.0 μmol/kg时,VBZ组与130P4组大鼠自主活动运动距离均呈剂量依赖性降低。相同物质的量给药剂量下,130P4组大鼠运动距离减少程度高于VBZ组。

与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01。图2 给药后1 h内大鼠平均自主活动Fig.2 Mean locomotor activity of rat within 1 hour after administration

2.3 130P4对大鼠自主活动影响的时间效应关系

实验结果如图3所示,与对照组相比,5.0 μmol/kg VBZ组大鼠在给药后0～8 h各时间段内自主活动运动距离均降低,其中在给药后0～5 h各时间段内自主活动运动距离与对照组相比有显著性差异;5.0 μmol/kg 130P4组大鼠在给药后0～8 h各时间段内自主活动运动距离均显著降低。

与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01。图3 给药后大鼠不同时间段的自主活动Fig.3 Locomotor activity of rat at different time periods after administration

VBZ和130P4组大鼠自主活动运动距离减少率随时间变化曲线如图4所示,130P4在给药后0～2 h内运动距离减少率逐渐升高,在给药后2～8 h内运动距离减少率逐渐降低,其对自发活动的抑制作用至少持续8 h。除给药后2～3 h外,其他时间段内130P4组大鼠自主活动运动距离减少率均高于VBZ组。

图4 大鼠自主活动减少率Fig.4 Reduction rate of locomotor activity in rat

2.4 130P4对大鼠眼睑下垂的影响

实验结果如图5所示,与对照组相比,2.5 μmol/kg VBZ组大鼠在给药后第1、2和4小时眼睑下垂评分均升高,其中给药后第2 h眼睑下垂评分与对照组相比有统计学差异。5.0 μmol/kg VBZ组大鼠在给药后第1、2、4和8小时眼睑下垂评分均升高,其中第1、2和4小时眼睑下垂评分与对照组相比有统计学差异;2.5 μmol/kg 130P4组大鼠在给药后第1、2、4和8小时眼睑下垂评分均升高,其中第1、2和4小时眼睑下垂评分与对照组相比有统计学差异。5.0 μmol/kg 130P4组大鼠在给药后第1、2、4和8小时眼睑下垂评分均显著升高。且相同物质的量给药剂量下,130P4组大鼠眼睑下垂评分高于VBZ组。

与对照组相比,**P<0.01。图5 给药后不同时间点眼睑下垂评分Fig.5 Palpebral Ptosis Scores at different time after administration

2.5 130P4对大鼠催乳素分泌水平的影响

实验结果如图6所示,与对照组(4.39 ± 1.85 ng/mL)相比,5.0 μmol/kg VBZ组大鼠血清催乳素水平(6.57 ± 4.91 ng/mL,P> 0.05)差异无统计学意义;5.0 μmol/kg 130P4组大鼠血清催乳素水平显著升高(22.78 ± 9.69 ng/mL,P<0.05)。

3 讨 论

VMAT2是位于突触前膜内囊泡膜上的转运蛋白,能够将突触前膜内胞浆中单胺递质如多巴胺、去甲肾上腺素和5-羟色胺等转运至囊泡内并进一步释放至突触间隙。VMAT2抑制剂可以拮抗VMAT2的转运功能,减少突触间隙的多巴胺释放,减轻TD症状。体外试验证实130P4对VMAT2具有高亲和力,Ki值为1.38 nmol/L,IC50为2.37 nmol/L。多巴胺释放减少可引起大鼠自主活动减少[10],单胺类递质释放阻滞可引起大鼠眼睑下垂[11-13]。在本研究中130P4剂量依赖性地降低大鼠自主活动、诱导大鼠眼睑下垂,表明130P4可通过抑制VMAT2减少单胺类递质多巴胺及去甲肾上腺素的释放。另外,DA与催乳素细胞膜上的D2受体结合,通过抑制腺苷酸环化酶和磷酸肌醇代谢而抑制催乳素基因的表达,或通过调控钾通道和钙通道抑制催乳素分泌[14]。130P4通过抑制VMAT2减少多巴胺释放,导致大鼠催乳素分泌增加。

前期研究显示VBZ主要活性代谢产物DHTBZ对大鼠脑VMAT2的Ki值为4.2 nmol/L[6]。3 mg/kg(7.0 μmol/kg)VBZ可减少大鼠自主活动运动距离,自主活动减少率约为60 %。VBZ诱导大鼠眼睑下垂的初始有效剂量为1 mg/kg,当给药剂量为3 mg/kg时,在给药后第3、6和9小时大鼠眼睑下垂评分升高且与对照组相比有统计学差异。VBZ在3 mg/kg(7.0 μmol/kg)给药剂量下,大鼠血清催乳素水平升高,但与对照组相比差异无统计学意义,VBZ相关实验结果与文献报道一致[8]。

实验室前期对130P4进行了部分体内药代动力学研究,实验结果显示,130P4与VBZ相同物质的量给药剂量下,在给药后0～12 h内各时间点,大鼠血浆和脑组织中130P4的浓度均高于VBZ及其代谢产物DHTBZ。血浆和脑组织中130P4的药时曲线下面积AUClast高于VBZ及其代谢产物DHTBZ。

4 结 论

上述结果显示,130P4与VMAT2亲和力高,可减少大鼠自主活动、诱导大鼠眼睑下垂和促进大鼠催乳素释放,对大鼠VMAT2具有抑制作用,相同物质的量剂量下对VMAT2的抑制作用优于VBZ。且前期研究结果显示相同物质的量给药剂量下,130P4在血浆和脑组织中的暴露量均高于VBZ。与VBZ相比,130P4显示了更好的药效及药代特征,为TD的治疗提供新的候选药物。