化脓隐秘杆菌对奶牛脾脏组织细胞凋亡的影响

范春玲，颜廷富，张林雁，王洋，周玉龙，孙斌，郭东华，原冬伟，赵明迪，吴海燕，刘琳珊

1. 黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319；2. 黑龙江八一农垦大学人文学院，黑龙江 大庆 163319；3. 黑龙江八一农垦大学校医院，黑龙江 大庆 163319

化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes，T. pyogenes）是人畜共患病的重要病原体，由于其致病机理尚不明确，且无有效的疫苗及特效药物，严重威胁动物和人类的生命健康［1-3］。

前期研究证明，化脓隐秘杆菌可引起奶牛肾和肺实质细胞发生坏死及凋亡［4-5］。化脓隐秘杆菌是否也会引起奶牛脾脏实质细胞凋亡，目前尚不完全清楚。脾脏是机体最大的免疫器官，占全身淋巴组织总量的25%，是机体细胞免疫和体液免疫的中心。脾脏的损伤会影响机体其他脏器的功能，从而影响机体的生命活动。因此，本研究通过对化脓隐秘杆菌自然感染奶牛（以下称病牛）脾脏组织的病理学变化的观察及其凋亡相关蛋白表达的检测，确定化脓隐秘杆菌感染是否会引起奶牛脾脏组织细胞凋亡，以探讨化脓隐秘杆菌的致病机理。

1 材料与方法

1. 1 主要试剂 兔抗牛Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2 多克隆抗体和鼠抗牛Bax 单克隆抗体，以及山羊抗兔（SP-0023）、山羊抗小鼠（SP-0024）、SP Kit（Mouse）和Kit（Rabbit）试剂盒，均购自北京博奥森生物技术公司；柠檬酸盐抗原修复液、胰蛋白酶试剂盒、多聚赖氨酸和DAB 染色液购自福州迈新生物技术开发有限公司；甲醛、松节油、乙醇、石蜡、中性树脂等化学试剂均为国产分析纯；苏木素和伊红染色液购自北京索莱宝科技有限公司。

1. 2 脾脏病理组织切片制备及其病理组织学变化观察 取2 头化脓隐秘杆菌检测阴性的奶牛（对照牛）和5 头自然感染化脓隐秘杆菌的患病奶牛（病牛），均由大庆地区提供，无菌采集脾脏组织，中性甲醛固定后，采用本课题组国家发明专利方法［6］，制作石蜡切片，经HE 染色，镜下观察病理组织学变化。

1. 3 脾脏组织中凋亡相关蛋白表达的检测 采用本课题组国家发明专利［6］与常规免疫组织化学方法相结合后的改进方法（松节油替代二甲苯），检测凋亡相关蛋白 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Bcl-2 的表达情况。将脾脏组织石蜡切片经松节油脱蜡、梯度酒精脱水后，流水及PBS 洗涤，吸干组织周边水分，胰酶和柠檬酸盐双重法进行修复抗原，PBS洗涤，吸干组织周边水分。Bax 检测采用SP Kit（Mouse）试剂盒，其他蛋白检测采用Ki（tRabbit）试剂盒。用3% H2O2消化内源性过氧化物酶，PBS 洗涤，加入非免疫动物（小牛）血清封闭；弃血清，加入一抗［兔抗牛 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2多克隆抗体和鼠抗牛Bax 单克隆抗体（除Caspase-3为 1 ∶300 稀释外，其他抗体均为 1 ∶400 稀释）］，4 ℃过夜；室温平衡后，PBS 洗涤，分别加入山羊抗兔和山羊抗小鼠，链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液孵育；PBS 洗涤，DAB 显色；苏木素复染；流水洗涤，烘干后直接封片。凋亡相关蛋白阳性表达表现为胞浆内可见棕褐色颗粒。

1. 4 统计学分析 每个组织切片选择0. 20 mm 的25 个区域表达的阳性细胞，随机选择4 个对角线区域，记录实验结果。应用Cochran-Con 两样本平均数近似t 检验方法，SPSS 17. 0 系统软件对实验结果进行统计学分析，以P ＜0. 05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2. 1 奶牛脾脏组织的的病理学变化 肉眼观察可见，病牛脾脏呈红褐色，肿大，柔软，见图1。病理组织学观察可见，病牛脾脏组织出血，淋巴组织疏松水肿，淋巴细胞数量减少，部分可见变性坏死，见图2。表明化脓隐秘杆菌可引起奶牛脾脏出血及淋巴细胞变性坏死。

图1 病牛脾脏的肉眼观察Fig. 1 Visual observation of spleens of cows infected with T. pyogenes

图2 病牛及对照牛脾脏组织的病理学观察（HE 染色，×400）Fig. 2 Histopathological change of spleens of cows infected with T. pyogenes and healthy cows（HE staining，× 400）

2. 2 各组牛脾脏组织细胞凋亡蛋白的表达

2. 2. 1 Caspase-3 蛋白 病牛脾脏组织Caspase-3表达阳性，阳性表达细胞分布在脾窦、淋巴小结和动脉周围淋巴鞘；对照牛脾脏组织可见少量Caspase-3阳性表达细胞。见图3。病牛脾脏组织Caspase-3 蛋白表达量高于对照牛，差异有统计学意义（t=21.923，P < 0. 05），见表 1。

2. 2. 2 Caspase-8 蛋白 病牛脾脏组织可见少量Caspase-8 阳性表达细胞，分布在脾脏动脉周围淋巴鞘和淋巴小结内；对照牛脾脏组织可见少量Caspase-8阳性表达细胞。见图3。病牛脾脏组织Caspase-8蛋白表达量与对照牛相比，差异无统计学意义（t =2. 073，P > 0. 05），见表 1。

2. 2. 3 Caspase-9 蛋白 病牛脾脏组织Caspase-9表达阳性，脾小梁周围可见阳性细胞；对照牛脾脏组织Caspase-9 表达阴性。见图3。病牛脾脏组织Caspase-9 蛋白表达量高于对照牛，差异有统计学意义（t = 34. 300，P < 0. 05），见表 1。

2. 2. 4 Bax 蛋白 病牛脾脏组织Bax 表达阳性，脾动脉周围鞘、淋巴小结以及脾窦中有阳性表达细胞；对照牛脾脏组织可见少量Bax 表达阳性细胞。见图3。病牛脾脏组织Bax 蛋白表达量高于对照牛，差异有统计学意义（t = 17. 085，P < 0. 05），见表1。

2. 2. 5 Bcl-2 蛋白 病牛脾脏组织可见少量Bcl-2 阳性表达细胞；对照牛脾脏组织Bcl-2 表达阴性。见图3。病牛脾脏组织Bcl-2 蛋白表达量与对照牛相比，差异无统计学意义（t = 1. 750，P > 0. 05），见表 1。

表1 凋亡蛋白在奶牛脾脏组织中的阳性表达细胞数量（个／ 0. 20 mm2，）Tab. 1 Number of lymphocytes positive for expressions Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9，Bax and Bcl-2 in spleens of cows（lymphocytes ／ 0. 20 mm2，）

表1 凋亡蛋白在奶牛脾脏组织中的阳性表达细胞数量（个／ 0. 20 mm2，）Tab. 1 Number of lymphocytes positive for expressions Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9，Bax and Bcl-2 in spleens of cows（lymphocytes ／ 0. 20 mm2，）

组别 n Caspase-3 Caspase-8 Caspase-9 Bax Bcl-2对照牛 2 4. 00 ± 1. 58 6. 00 ± 2. 12 2. 80 ± 0. 97 2. 60 ± 0. 81 2. 20 ± 1. 07病牛 5 39. 00 ± 2. 55 10. 40 ± 3. 36 30. 00 ± 0. 89 18. 20 ± 1. 59 0. 80 ± 0. 58

图3 脾脏组织凋亡蛋白的表达（DAB，× 400）Fig. 3 Expressions of Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9，Bax and Bcl-2 in spleen tissue（DAB，× 400）

根据以上阳性细胞分布和形态学特征，确定这些实质细胞为淋巴细胞。

3 讨 论

化脓隐秘杆菌可引起化脓性肺炎、肝脏脓肿、化脓性关节炎、化脓性乳房炎等疾病。化脓隐秘杆菌有多种毒力因子，但主要的毒力因子有4 种：胆固醇依赖的溶血胞素pyolysin（PLO）、神经氨酸酶（NanH和 NanP）、菌毛合成蛋白（FimA、FinC、FimE 和 FmG）和胶原结合蛋白（CbpA）［7-9］。目前对毒力因子致病机理的研究尚不深入。铁ABC（ATP binding cassette，ATP 结合盒）转运体的底物结合蛋白是一种新发现的化脓隐秘杆菌保护性抗原［10］。

由于缺乏有效的疫苗，至目前为止，化脓隐秘杆菌引起的感染主要依靠抗菌药物来治疗。有关化脓隐秘杆菌耐药性的报道越来越多，尤其是对临床常用的大环内酯类和四环素类抗生素的耐药问题［11-12］。苏鸿雨等［13］研究证明，利血平可能是通过抑制外排基因mef A 的转录和翻译而消减化脓隐秘杆菌对大环内酯类抗生素的耐药性。

前期研究证明，化脓隐秘杆菌可引起奶牛多个脏器化脓，肾、肺实质细胞坏死及凋亡，其中线粒体通路发挥重要作用［4-5］。用化脓隐秘杆菌HJ-1 型感染山羊，发现山羊接种牛源化脓隐秘杆菌7 d 后死亡，接种部位皮肤坏死，胸腔积液、胸膜增厚，各脏器肿大、出血、坏死，以肺脏病变较为明显，表现为坏死性、化脓性炎［14］。用化脓隐秘杆菌HJ-1 型建立小鼠模型［15］，结果显示，化脓隐秘杆菌HJ-1 型在含5%血清的BHI 液体培养基中培养12 ～14 h 为该菌的对数生长期，此时的细菌数为8. 4 × 1010cfu；化脓隐秘杆菌HJ-1 型对小鼠的半数致死量（LD5）0为4. 16 ×108cfu。

本文主要研究牛化脓隐秘杆菌对奶牛脾脏细胞凋亡的影响。凋亡的信号通路至少包括3 条：死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径。Caspase-3、Caspase-8 和 Caspase-9 是凋亡通路中的相关蛋白。Caspase-8 是死亡受体途径关键的启动型 Caspase；Caspase-9 是线粒体凋亡途径的启动关键蛋白酶；Caspase-3 是凋亡的主要执行者。抗凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax 均为Bcl-2 家族成员。Bax 是线粒体应激引起细胞凋亡的关键组分，受凋亡性刺激后，Bax 形成寡聚体并转位至线粒体膜，增加膜的通透性并导致Cyt-c 释放，进而激活Caspase 途径，启动细胞凋亡；而 Bcl-2 能够通过改变Bax 空间构象抑制细胞凋亡［16-17］。

从实验结果可知，病牛脾脏呈红褐色，肿大，有出血灶。而病理性观察可见，脾脏组织出血，淋巴组织疏松水肿，淋巴细胞数量减少，可见变性坏死。病牛脾脏，淋巴小结、动脉周围淋巴鞘和脾窦中可见Caspase-3、Caspase-9、Bax 阳性表达细胞，这些阳性表达细胞为淋巴细胞。而病牛脾脏组织中仅可见少量Caspase-8 和Bcl-2 阳性表达细胞，与对照牛相比，差异无统计学意义（P ＞0. 05）。Caspase-3 表达阳性，表明病牛脾脏淋巴细胞发生了凋亡；Caspase-8 表达阴性，表明死亡受体途径非牛脾脏淋巴细胞凋亡的主要途径；Caspase-9 表达阳性，表明线粒体途径是牛脾脏淋巴细胞凋亡的主要途径；Bax 表达阳性及Bcl-2 表达阴性，表明病牛脾脏淋巴细胞内Bax 和Bcl-2 比率发生了改变。

综合以上实验分析得出，化脓隐秘杆菌可通过调节奶牛脾脏淋巴细胞Bcl-2 家族的活性，引起其Bax 和Bcl-2 比率改变，增加淋巴细胞线粒体内外膜通透性，导致和凋亡相关的因子释放，激活细胞内Caspase-9，进一步激活细胞内Caspase-3，从而引起脾脏淋巴细胞凋亡。脾脏淋巴细胞的凋亡和坏死可导致免疫功能障碍。同时化脓隐秘杆菌感染奶牛的肺脏实质细胞发生凋亡和坏死［4］，引起呼吸功能衰竭；而肾脏实质细胞发生凋亡和坏死［5］，引起肾功能衰竭，又引起全身多个脏器系统功能衰竭，最后导致奶牛死亡。因此，抑制宿主细胞凋亡，是防治奶牛化脓隐秘杆菌感染的一个新的科学思路。