PRP 明胶微球对大鼠压力性尿失禁的治疗作用

周谋 林放 李文丹 孙宇 单桂秋 施琳颖

随着二胎政策的放开,女性产后出现的一系列的问题逐渐受到了广泛的关注。其中SUI 作为一种影响生活质量的产后常见病,会给患者带来严重的生理和心理影响［1］。SUI 主要的临床表现为咳嗽、打喷嚏等腹压突然增加时,尿液不自主地流出。这种疾病虽然对生命不会造威胁,但给女性的身心健康以及生活质量带来了严重的影响［2,3］。外科手术是治疗SUI 最有效也是最快捷的方式之一,但外科手术有其局限性,比如对固有尿道括约肌功能障碍的患者,手术就不是最有效的方法,而且操作时常会伴随尿路感染、膀胱损伤、排尿功能障碍、发热等手术并发症,因此,使用注射疗法治疗SUI,成为了临床医生关注的焦点。本研究通过建立大鼠压力性尿失禁模型,并在大鼠尿道中段注射PRP 明胶微球,观察其在压力性尿失禁模型大鼠中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 成年雌性SD 大鼠32 只,体重为220～250 g,实验动物许可证号：SCXK(粤)2011-0015。实验动物由南方医科大学动物实验中心提供,符合动物伦理学要求。

1.1.2 主要设备 真空冷冻干燥机(广州倍立思仪器有限公司,型号Alphal-4 LSC Plus)、生物安全柜(广州市苏泰空调净化设备有限公司,型号AIRTECH)、水浴两用振荡器(上海悦丰上海悦丰仪器仪表有限公司,型号SH2B)、TCH 纯水机(杭州天创净水设备有限公司,型号TCH-RO/20)、磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限公司,型号DH-101S)、电子精密天平(德国Sartorius公司,型号BS124S)等。

1.1.3 主要材料 PRP(本研究团队自制)、固体明胶［西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司,G7041-500G,批号1002047083］；Span 80(天津恒兴化学试剂厂,批号 20150107,化学纯)、25%戊二醛(国药集团化学试剂有限公司,批号20150617,化学纯)、异丙醇(广州化学试剂厂,批号20150910-2,分析纯)、丙酮(广州化学试剂厂,批号20150209,分析纯)、石油醚(天津市百世化工有限公司,批号GB/T 15894-2008,分析纯)、液体石蜡(山东利尔康医疗科技股份有限公司,批号141119,化学纯)等。

1.2 方法

1.2.1 空白明胶微球制备

1.2.1.1 将3.0 g 固体明胶加入20 ml 的蒸馏水中,在50℃条件下搅拌溶解。完全溶解后,放置在50℃水浴箱中进行孵育,待用。

1.2.1.2 将1.5 ml Span 80 加入100 ml 的液体石蜡中混匀。将50℃恒温磁力加热搅拌器转速调为750～825 r/min 后,将上述混合物置于搅拌器中搅拌,并缓慢加入明胶溶液,乳化10 min。

1.2.1.3 乳化后快速将上述混合物转入到冰水浴中,将温度速降至4℃后,继续搅拌15 min。

1.2.1.4 加入适量25%戊二醛预固化5 min,加入100 ml 25%戊二醛,4℃冰箱放置24 h。

1.2.1.5 24 h 后取出倒掉上清,加入100 ml 异丙醇脱水2 h。

1.2.1.6 按照丙酮、异丙醇、石油醚洗涤的顺序,交替洗涤3 次,用真空抽滤机进行抽滤。将抽滤后的沉淀物放置于60℃干燥箱中干燥,即得到空白明胶微球。

1.2.2 PRP 明胶微球制备

1.2.2.1 将100 U/ml 凝血酶和100 mg/ml 的葡萄糖酸钙溶液混合,制备成PRP 激活剂。

1.2.2.2 将冻存PRP 与血小板激活剂按体积比10∶1混合,置于37℃水浴箱中水浴30 min 后在220 g 条件下离心20 min,取上清即得到富血小板凝胶(PG)上清。

1.2.2.3 将100 μl PG 上清加至装有10 mg 空白明胶微球的无菌EP管中,充分混匀后置于4℃冰箱浸润24 h。

1.2.2.4 充分浸润后,将EP 管置于-80℃超低温冰箱中预冻过夜。

1.2.2.5 次日先将真空冷冻干燥机冷阱温度降至-46℃,温度达到后将EP 管移入真空冷冻干燥机进行真空干燥(真空度＜133 mbar)24 h 后,随后取出待用。使用时用生理盐水按体积比1∶1 混合制成PRP 明胶微球溶液。

1.2.3 压力性尿失禁大鼠模型的建立

1.2.3.1 SD 大鼠麻醉后,将不同型号的扩张器依次插入大鼠阴道内,当型号为34 F 的扩张器能无阻力进入大鼠的阴道后,取出扩张器。在阴道内插入末端为球囊的导管后,在阴道外口进行缝合。

1.2.3.2 缝合完毕后,在球囊内缓慢注射3 ml 的生理盐水,使球囊一直属于极度扩张状态,并开始计时。见图1。

图1 大鼠阴道扩张操作图

1.2.3.3 扩张4 h 后,将球囊内的生理盐水缓慢放出。待生理盐水排空后,剪开阴道外口的缝线取出导管。

1.2.3.4 对SD 大鼠行喷嚏实验,验证压力性尿失禁大鼠造模成功。

1.2.3.5 将32 只阴道扩张大鼠随机分为4组,每组8 只：A 组为假手术对照组(空白对照组)、B 组为生理盐水组(对照组1)、C 组为空白明胶微球组(对照组2)、D 组为PRP 明胶微球组(实验组)。用剃毛器将下腹部皮肤的毛发剃光,使用无菌棉球进行碘伏消毒后,用无菌刀片在下腹部行正中切口,切口长度约1 cm。依次切开皮肤、腹壁层后,暴露尿道和膀胱颈部。

1.2.3.6 假手术对照组切开下腹部暴露膀胱和尿道后,不注射任何物质后,直接关闭腹壁。其余三组用微量注射器吸取各组溶液,分别于距膀胱0.5 cm 处的尿道近腹端3 点和9点的位置进针,每一侧都同时注射100 μl 各组溶液,进针角度为30°,使局部隆起一小丘后留置针头约5 s,再慢慢地拔出针头。

1.2.3.7 手术后3、5、7、14、21 d 进行HE 染色和Masson 染色。

1.3 观察指标 观察各组造模结果、HE 染色和Masson 染色结果。

2 结果

2.1 造模结果 32 只SD 大鼠喷嚏实验阳性为28 只,成功率为 88%(28/32),4 只在喷嚏实验时出现逼尿肌不稳定性收缩。假手术对照组分配2 只喷嚏实验阴性大鼠、生理盐水组、空白明胶微球组和PRP 明胶微球组各分配1 只。

2.2 HE 染色结果 由结果可知,A、B、C 组平滑肌排列稀疏,肌肉束的间隔增大；D 组平滑肌排列较整齐,肌肉束的间隔较致密。见图2A-D。

2.3 Masson 染色结果 由结果可知,A、B、C 组可明显地观察到尿道外括约肌有广泛的断裂,肌肉排列紊乱；A、B 组无明显胶原纤维(蓝色)沉积,C 组可见胶原纤维沉积。D 组肌肉排列较完整,且胶原纤维沉淀明显。见图2E-H。

图2 21 d 病理染色结果图

3 讨论

SUI 主要治疗方式为保守治疗和手术治疗,但近年来,利用微创手术治疗SUI 得到了快速发展,其中注射治疗受到关注。有研究证明,注射单一生长因子可促进体外培养的SUI 患者的肛提肌成肌细胞增殖［4］。

SUI 患者的盆底损伤、退化松弛或功能缺陷与胶原蛋白的代谢和异常有着密切的关联,胶原含量的降低,直接引起了盆底支持的组织弹性减弱,从而导致盆底松弛。转化生长因子-β1(TGF-β1)作为盆底组织最重要的保护性因子之一,与胶原的合成、降解有着直接的关系。TGF-β1含量的高低,直接影响了基质降解酶及其抑制因子的数量与活性,在盆底支持组织损伤的修复过程中,起着关键性的修复作用［5,6］。

PRP 是自体全血通过离心后获得的高浓度血小板的血液制品,使用凝血酶和钙离子共同激活后,可形成PG。该凝胶和其上清均可以释放多种促进创面修复的生长因子,如转化生长因子-β1、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子等。这些生长因子有相互的协同作用,共同促进着创面的修复和愈合［7,8］。PRP 在改善卵巢功能方面有着优良的表现,可有效增加子宫内膜厚度［9］、恢复卵巢储备功能［10］和调节性激素水平［11］,因此受到了妇产科医生们的广泛关注。明胶作为胶原的降解产物,是动物的皮、骨等结缔组织中胶原经部分水解和热变性而成的大分子蛋白质,其理化性能好,安全无毒且生物相容性好,已成为了控释剂的理想载体［12］。有研究表明载IGF-1 的明胶微球,能有效促进受损的尿道括约肌的恢复及血管再生,可明显提高大鼠的尿控功能以及改善组织结构［13,14］。为此,本课题组将PRP 和明胶微球联合应用,研制出了一种可缓释多种生长因子的明胶微球。从病理实验结果可以看出,假手术对照组、生理盐水组和空白明胶微球组可以看到尿道外括约肌损伤较严重,平滑肌排列稀疏,肌肉束的间隔增大,数量也相应减少。而PRP 明胶微球组的尿道外括约肌的层数比其他组有明显的恢复,尿道外括约肌的形态结构也相对完整。

综上所述,PRP 明胶微球除缓释效果和安全性良好外,其促进组织和细胞恢复的效果也较好,有望成为未来治疗SUI 的一种新方法,下一步我们将继续研究其使用的适应证、最佳的注射剂量、部位及时间,为治疗SUI 提供新思路。