生物炭与氮肥配施对植烟土壤微生物及碳氮含量特征的影响

冯慧琳，何欢辉，徐 茜，李小龙，张 帆，姬小明，徐辰生*，任天宝*，刘国顺

（1．河南农业大学烟草学院/河南省生物炭研究工程技术中心，河南 郑州 450002；2．福建省烟草公司南平市公司/南平烟草科学研究所，福建 南平 353000；3．龙岩市烟草公司上杭分公司，福建 龙岩 364200）

土壤健康培育和根际微生物调控是实现农业绿色高质量发展的重要基础和途径［1］。生物炭作为一种土壤改良剂具有较强的吸附力、极大的比表面积和发达的孔隙结构，在土壤微生态调控、土壤固碳培肥和缓解温室效应等方面具有良好的效应［2-5］。土壤微生物是土壤生态的重要组成部分，微生物的数量和新陈代谢的变化都会直接作用于土壤，使土壤养分及结构发生改变［6-7］。Prayogo等［8］研究发现生物炭能够改变土壤微生物定殖栖息地的理化性质，从而改变土壤微生物的群落结构。同时Ameloot等［9］也发现生物炭能够为土壤微生物提供一个舒适的栖息环境，刺激土壤微生物发生改变。

氮是植物必需的营养元素之一，是限制作物产质量的重要因子，氮肥施用过多或不足均会对土壤及环境造成不良影响［10-12］。近年来有大量研究表明，生物炭能够提升土壤氮素利用率［13-14］，Wang等［15］研究发现生物炭增加了土壤中有效氮、磷、钾的含量，改变了土壤物理结构，促进了烤烟根系的健康发展。Oladele等［16］研究发现生物炭与氮肥配施能够减少硝酸盐的淋失、提高水稻产量和土壤养分的有效性。Chaplot等［17］研究证明基于山核桃生产的生物炭能够减少土壤中硝酸盐的浸出。因此，人们把目光聚集在生物炭与氮肥减施上，以期探究出最有利于土壤健康和可持续性发展的精准施肥模式。沈仁芳等［18］提出，土壤研究已经从单一的生产功能研究阶段进入到生产、环境、生态多目标多功能系统的研究阶段。本研究基于土壤健康、土壤微生态环境发展的角度，在邵武烟区深入开展植烟土壤施加生物炭并采取减氮措施试验，从土壤-根系-微生物互作过程对植株养分高效利用的影响入手，以期为我国植烟土壤健康培育和绿色农业发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验于2018年2～10月在福建省南平市邵武市沿山镇进行，该烟区为烟稻轮作，植烟土壤均为砂壤土，土壤基本理化性质见表1。试供烤烟品种为K326，由福建省南平市邵武市公司提供。试验小区选择有代表性、前茬作物一致、土壤肥力均匀、肥力中等水平的地块。生物炭由河南省生物炭工程技术研究中心提供，原材料为花生壳，在380～400℃条件下低氧、连续炭化5～6 min制得，粉碎后过筛（孔径2.00 mm），其基本理化性质见表2。

表1 土壤基本理化性质

表2 生物质炭基本理化性质

1.2 试验方法

试验设一个空白对照、一个常规施肥、4个不同生物炭用量配合不同程度的减氮处理，每个处理重复3次，6个处理具体的施肥配比及小区面积见表3。空白对照CK1不施加任何肥料，CK2按照当地常规施肥模式为：烟草专用肥525 kg/hm2（N：12.5%，P2O5：8.0%，K2O：22.5%）、芝麻饼肥675 kg/hm2（N：5.8%，K2O：1.3%）、钙镁磷肥459 kg/hm2、氢氧化镁187.5 kg/hm2、硝酸钾345 kg/hm2、硫酸钾300 kg/hm2，氮、磷、钾比例为1∶0.78∶2.87。施肥处理的氮肥基、追肥比例为7∶3（70%作为基肥，30%作为追肥），基肥采用条施，追肥于移栽后30 d施用。

表3 试验处理设计

该试验于2月23日进行烟田整地、施肥及起垄工作，所有物料于起垄前一天条施，施用生物炭后，将其他物料混匀后撒施于生物炭上。烟苗于3月4日进行移栽，采用膜下移栽方式，5月8日开始逐一打顶，5月18日开始进行烟叶采烤。该试验区烟叶于7月11日全部采收完，7月27日烟叶全部烘烤完毕。

1.3 土壤养分及碳、氮含量分析方法

在烟株移栽后45、60、75、90 d时，根据5点取样法确定取样点，用铲子将烟株周围10 cm的土壤挖至30 cm的深度，切割土壤中烟株的任何侧根，挖出烟株整个根部。将根球放入盆中，摇动根部，用铲子从根部去除土壤，采集盆中的土壤放入密封袋中，常温避光条件下风干、磨细、过筛，进行土壤样品分析。测定方法参照文献［19］，有效磷测定采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-钼锑抗比色法；速效钾测定采用0.5 mol/L NH4OAc浸提-火焰光度法；碱解氮测定采用碱解扩散法；称取过0.149 mm筛的风干土样20 mg，采用 VarioEL III 型元素分析仪测定样品中的全碳含量。

1.4 土壤微生物分析方法

在烟株移栽后75 d时，根据5点取样法确定取样点，用铲子将烟株周围10 cm的土壤挖至30 cm的深度，切割土壤中烟株的任何侧根，挖出烟株整个根部。将根球放入盆中，摇动根部，用铲子从根部去除土壤，采集盆中无碎块的土壤5～10 g，除去植物根、动物残骸及其他杂质，混匀过2 mm筛，保存在10 mL无菌离心管中，用干冰保存送往上海美吉生物科技有限公司，对采集的土壤样品进行土壤微生物多样性检测。

土壤DNA提取和PCR扩增：用E.Z.N.A.®soil试剂盒（Omega Bio-tek，Norcross GA USA）提取总DNA，DNA的浓度和纯度利用NanoDrop2000超微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific公司）来进行检测，DNA提取质量利用1%琼脂糖凝胶电泳来检测；细菌16S rRNA用338F（5′-ACTCCTAC GGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3′）引物对V3～V4可变区进行PCR扩增，真菌18S用SSU0817F（5′-TTAGCAT GGAATAATRRAATAGGA-3′）和1196R（5′-TCTG GACCTGGTGAGTTTCC-3′）引 物 对V5～V7可 变区进行PCR扩增［20］，扩增的程序为：95℃预变性3 min，27个循环（95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），最后72℃延伸10 min（PCR仪：ABI GeneAmp® 9700型）。扩增体积为20 μL，4 μL 5×FastPfu缓冲液，2 μL 2.5 mmoL dNTPs，0.8 μL引物（5 Um），0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。

Illumina Miseq测序：PCR产物用2%琼脂糖凝胶回收，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST（Promega，USA）进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台（Illumina，San Diego，USA）标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300的文库，构建文库步骤：（1）连接“Y”字形接头；（2）使用磁珠筛选去除接头自连片段；（3）利用PCR扩增进行文库模板的富集；（4）氢氧化钠变性，产生单链DNA片段，利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。

1.5 统计方法

采用Excel 2016分析数据，用DPS 7.0分析处理数据，方差分析采用最小显著性差异法。微生物处理使用UPARSE软件，根据97%的相似度对序 列 进 行Operational Taxonomic Units（OTUs）聚类；使用UCHIME软件剔除嵌合体。利用RDP classifie对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库（SSU123），设置比对阈值为70%。韦恩图分析时选用相似水平为97%的OTUs的样本表，利用R语言进行统计和作图。可视圈图利用Circos-0.67-7软件。Qiime计算beta多样性距离矩阵，R语言vegan软件包进行NMDS分析和作图。

2 结果与分析

2.1 生物炭与氮肥配施对土壤有效磷、速效钾、碱解氮含量的影响

有效磷是土壤中可被植物吸收的磷组分，能够促进植物早期根系的形成和生长，提高植物适应外界环境的能力，可增强植物的抗旱性及抗寒性。从图1可以看出，各处理的有效磷含量随着生育期的增加而减少，在移栽后75 d生物炭与减氮处理的有效磷含量高于CK2处理。在移栽后90 d时差异最明显，T1至T4的有效磷含量与CK2相比分别增加了31.81%、47.15%、82.22%、32.87%。说明生物炭与减氮处理能够增加土壤中的有效磷含量，且以T3处理增幅最大。

烟株对钾素的吸收是在烤烟生长发育的早期，因此保证早期的钾素供应是十分必要的。从图2可以看出，T4处理在烟草移栽后60 d时土壤中速效钾的含量最大，达276.87 mg/kg，显著高于未加生物炭的处理。T4处理在烟草的4个生育期里，土壤速效钾含量都显著高于CK2，分别显著增加了11.89%、35.11%、25.95%、15.85%。说明生物炭与减氮处理能够在烟株生长前期保证土壤中钾素含量以供烟叶吸收。

土壤中的碱解氮含量能够反映烟株对氮素的吸收、利用情况，碱解氮含量的提升会使土壤的供氮能力增强，能够满足烟株对氮素的需求，促进植株对养分的吸收。从图3能够看出，生物炭与减氮处理能够提升土壤碱解氮的含量，其中移栽后45、60、75 d以T3处理的碱解氮含量最大，移栽后45 d含量为187.92 mg/kg，较CK2处理增加了16.66%。4个生物炭配合减氮处理在移栽后90 d时均与CK2处理存在显著性差异，分别较CK2处理增加了7.21%、8.03%、12.41%、12.76%。

2.2 生物炭与氮肥配施对土壤全碳含量及土壤碳氮比的影响

在烟草生长前期，常规施肥与生物炭配合减氮处理部分存在显著性差异，但随着生长期的增加，差异越来越不显著，到成熟期时，各处理间的全碳含量不存在显著性差异。由图4可以看出，移栽后45 d时，T1至T4的全碳含量较CK2分别增加了1.29%、3.89%、12.44%、5.62%。在整个烟草生育期中T3处理土壤的全碳含量一直高于其他处理，除移栽后90 d与CK2不存在显著性差异外，其它3个时期均与CK2差异显著，且4个时期较CK2分别增加了12.44%、18.48%、16.58%、6.15%。所以在土壤中施加生物炭与减氮处理会使土壤全碳含量在烟草生育前期有所增加，且以T3处理效果最佳。

由图5可以看出，施用生物炭能够提升土壤碳氮比，生物炭高添加量的提升作用大于低添加量。随着烟草生育期的增加，各处理之间土壤碳氮比差距减少。从烟草整个生育期来看，T3、T4处理的土壤碳氮比始终与CK1、CK2处理存在显著性差异，且4个时期T4处理较CK2处理分别增加了5.44%、4.85%、2.57%、4.18%。

2.3 生物炭与氮肥配施对土壤微生物的影响

2.3.1 土壤微生物样本测序的结果

所有样本真菌测序共获得1523483条有效序列，细菌测序共获得1581998条有效序列。由图6（a）能够看出，细菌中所有样本所共有的OTUs总数为1715，CK1、CK2、T1、T2、T3、T4处理所特有的OTUs数目分别为59、35、19、3、7、3。由图6（b）能够看出，真菌中所有样本所共有的OTUs总数为161，CK1、CK2、T1、T2、T3、T4处理所特有的OTUs数目分别为6、1、4、5、2、4。总的来说，生物炭与氮肥配施处理较CK1、CK2处理在细菌中的差异较大。

2.3.2 土壤微生物物种组成

不同样本中优势菌种的组成是相似的，但是每一菌种在每一样本中所占的比例是完全不同的。通过可视化圈图来展现每个处理中优势物种的分布比例及各优势物种在不同处理中的分布比例。由图7（a）可以看出，土壤细菌的优势菌纲是放线菌纲（Actinobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、纤线杆菌纲（Ktedono-bacteria）和酸杆菌纲（Acidobacteria）。4个生物炭配合减氮处理的放线菌纲相对丰度较CK2处理分别减少了16.67%、11.11%、22.22%、5.56%，4个生物炭配合减氮处理的酸杆菌纲相对丰度较CK2处理分别减少了18.75%、0.00%、11.11%、11.11%，说明生物炭与减氮处理会减少放线菌纲（Actinobacteria）及酸杆菌纲（Acidobacteria）的相对丰度。T2处理的γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）相对丰度最高，较CK1、CK2处理分别增加了23.53%、9.52%。由图7（b）可以看出，土壤真菌的优势菌纲为粪壳菌纲（Sordariomycetes）、散囊菌纲（Eurotiomycetes）、子囊菌门某纲（norank_p_Ascomycota）。T1处理的粪壳菌纲（Sordariomycetes）相对丰度最高，较CK1、CK2处理分别增加了29.41%、15.79%。各处理散囊菌纲（Euroti om ycetes）相对丰度大小排列为：T2>CK1>T3>T4>T1=CK2，说明常规施肥会降低土壤中散囊菌纲（Eurotiomycetes）的相对丰度，但是通过生物炭与氮肥配施能够减缓降低作用，使其相对丰度提升，随着生物炭用量和减氮比例的增加，散囊菌纲（Eurotiomycetes）的相对丰度呈现先增加后减少的趋势。子囊菌门某纲（norank_p_Ascomycota）的相对丰度随着生物炭用量和减氮比例的增加，呈现先减少后增加的趋势，到T3处理相对丰度达到最低，T4处理的相对丰度最高，较CK2处理增加了86.67%。

2.3.3 土壤微生物β多样性

基于Bray-Curtis距离对6个处理的土壤细菌群落组成进行NMDS分析。由图8（a）能够看出CK1的土壤细菌群落与其余5个处理存在明显差异，T3、T4处理的土壤细菌群落组成更加相似。由图8（b）可知，T2、T3、T4处理的土壤真菌群落更加相似，与T1处理存在明显差异，说明生物炭用量和减氮比例的增加会导致土壤微生物真菌群落结构发生变化；与CK1、CK2处理也存在明显的差异，说明生物炭与氮肥配施会影响土壤微生物真菌菌群结构。

3 讨论

3.1 生物炭与减氮措施配合对土壤养分及碳含量的影响

生物炭本身的养分含量很低，但因其独特的物理特性，如较高的比表面积和较大的孔隙度，能够吸附土壤中的氮、磷、钾元素，减少它们的淋失［21］。由上述结果来看，植烟土壤中施入生物炭会改变土壤的养分情况，添加生物炭后能够提高土壤有效磷、速效钾的含量，Laird等［22］研究发现生物炭的孔隙结构对肥料养分的延长释放有作用，能够降低养分损失，增加土壤磷钾的有效性，与本文的研究结果相印证。但本试验会出现生物炭施用量大的处理有效磷含量小的情况，如移栽后90 d时，T3处理的有效磷含量大于T4处理。张阿凤等［23］的研究表明，适宜用量的生物炭不仅能够减少土壤有效磷的淋溶和固定，还可以吸附一部分的磷酸根，使得土壤有效磷含量增加幅度较大；但是过高用量生物炭对土壤的影响仅以吸附土壤的磷酸根为主，因此会导致有效磷含量增幅小，与本文的研究结果相印证。本研究中随着生物炭施用量的增加土壤中速效钾的含量也增加，这与前人的研究基本一致［24］。并且，这与生物炭能够提高土壤持水性有关，聂新星等［25］研究发现，土壤水分状况是影响土壤钾素固定和释放的重要因素，生物炭施入土壤后能够通过提高土壤持水能力从而影响土壤钾素含量。本研究发现生物炭能够增加土壤中的全碳含量及碳氮比，这与前人的研究相似［26］，且发现全碳和碳氮比均随着生物炭用量和减氮比例的增加呈现先增加后减少的趋势，进一步证实了生物炭能够保持土壤中的有机质不被降解和淋溶，且因其性质稳定施加到土壤中能够有助于土壤中腐殖质的形成，从而增加碳含量［27］。刘玉学等［28］研究表明，生物炭对NH4+、NO3-具有较强的吸附作用，因此土壤中添加生物炭能够减少氮素的淋溶，增加土壤中的氮素含量。对比CK2处理，生物炭处理能够增加土壤中的碱解氮含量，且存在显著性差异，与梁忠厚等［21］的研究结果相同。但是较高生物炭施用量及减氮的T4处理碱解氮含量却小于T3处理，主要原因是过量生物炭聚集在植株根际土壤区域，土壤微生物活性受到抑制，降低土壤氮素的有效性，从而表现为土壤氮含量的降低。

3.2 生物炭与减氮措施配合对土壤微生物的影响

土壤微生物是土壤中氮、碳等营养元素循环与转化的动力源泉，会通过降解凋落物等有机物质，释放植物能够利用吸收的养分，从而帮助土壤保持有效肥力［29-31］。从土壤微生物的韦恩图和NMDS分析图可以看出，生物炭与减氮措施配合对土壤细菌的影响大于对土壤真菌的影响。可能与生物炭能够提高土壤的pH［32］有关，一般有利于细菌繁殖的土壤pH高于有利于真菌繁殖的土壤pH［33］。施用生物炭对土壤微生物的群落结构会产生一定的影响，生物炭与氮肥配施处理较CK2处理增加了α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、纤线杆菌纲（Ktedonobacteria）、散囊菌纲（Eurotiomycetes）和子囊菌门某纲（norank_p_Ascomycota）的相对丰度。有研究表明生物炭具有独特的结构且含有丰富的营养物质，能够为土壤微生物提供一个更好、更舒适的栖息环境，能够刺激土壤微生物的相对丰度发生改变，有利于某些细菌、真菌的生长，与本文研究结果相印证［32］。本文也发现生物炭与氮肥配施处理较CK2处理放线菌纲（Actinobacteria）及酸杆菌纲（Acidobacteria）的相对丰度减少，可能是由于本文的生物炭与氮肥配施处理采用了减少氮肥的措施，导致土壤中的氮素较CK2没有那么的充足而不能很好地支撑某些细菌的生长代谢过程，从而引起某些细菌相对丰度的降低［34］，不过放线菌纲（Actinobacteria）多为致病菌，该菌的减少会降低土壤病害的发生概率，从而更加有利于土壤健康。

4 结论

生物炭与减氮处理能够在烟草的生长过程中改变植烟土壤的养分情况，适当减氮与生物炭的添加能够促进土壤碳氮平衡，改变土壤微生物的群落结构，使土壤向一个更加健康的环境改变，表明生物炭能够满足我国植烟土壤改良的同时还能实现农业“双减”，对烤烟实施肥料减施、有机肥替代部分无机肥的施肥措施提供理论依据。综上所述，以T3（常规施肥+氮肥80 kg/hm2+生物炭1350 kg/hm2）模式对土壤动态养分的影响最符合烤烟不同生育期养分需求，有利于土壤健康、土壤培育和植物根际土壤微生物调控。