淋巴上皮瘤样癌临床病理特征及PD-L1表达分析

周仁钰， 钟丽娟， 彭丽琳， 杨 波， 陆元志

淋巴上皮瘤样癌(lymphoepithelioma-like carcinoma,LELC)是发生于上皮源性的罕见恶性肿瘤，组织形态与未分化鼻咽癌相同，因较罕见而易被误诊为淋巴瘤或炎性病变。LELC可发生于全身多个器官，如涎腺、肺、皮肤、胸腺、胃、肝脏、泌尿系统和子宫颈等[1-2]，其中以肺内发生最常见，约占非小细胞癌的0.7%[3]。肺LELC常发生于较年轻且不吸烟的亚洲人群，性别上无明显差异[4]，与其他非小细胞肺癌患者相比，患者的诊断时间较早，预后更好[5]。本研究旨在探讨LELC临床病理特征以及程序性死亡配体1(programmed death-ligand 1,PD-L1)的表达情况，以期提高临床医师对其认识，避免误诊、漏诊。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2010年1月至2021年5月暨南大学附属第一医院临床病理科确诊的15例LELC的临床资料。其中男4例，女11例，年龄28～81岁，中位年龄59岁。病变发生于肺部10例，涎腺3例，肾盂1例，鼻腔1例。所有患者无鼻咽癌病史。

1.2HE染色法 15例标本均为手术切除后送检。所有标本经10%中性福尔马林固定，常规脱水、石蜡包埋、切片、HE染色。HE染色操作步骤：(1)将切片放入65 ℃烤箱烘烤30 min；(2)放置于二甲苯溶液中脱蜡3次，5 min/次；(3)放置于梯度乙醇中去除二甲苯，乙醇浓度依次为无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇,每次约为1 min，然后用自来水冲洗；(4)放入苏木素染液染色7 min，具体时间根据染色情况进行调整，水洗1 min，再放入1%盐酸酒精进行分化片刻后用自来水冲洗15 min，直到观察细胞核呈蓝色；(5)放入1%伊红染液染色1 min，再进行水洗；(6)放入梯度乙醇进行脱水，乙醇浓度依次为85%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、无水乙醇,每次约为1 min；(7)放入苯酚二甲苯、二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)中透明处理3次，每次约3 min；(8)用中性树胶封片；(9)光镜下观察。

1.3免疫组织化学染色法 采用EnVision二步法进行免疫组织化学染色，并评估各种抗体染色阳性结果。具体操作步骤：(1)将蜡块连续切片约4 μm，放入65 ℃烤箱烘烤30 min。(2)放入二甲苯脱蜡3次，每次约5 min。(3)再依次放入梯度乙醇去除二甲苯，乙醇浓度为95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、80%乙醇、75%乙醇，各2 min，洗去二甲苯。(4)将切片放置于抗原修复液(修复液类型：EDTA，pH 8.0)中，95 ℃ 20 min，使用Dako PT Link抗原修复仪修复，冷却至室温后取出，放置于蒸馏水中5 min。(5)将切片浸没于3%浓度过氧化氢溶液中，室温下10 min，蒸馏水冲洗干净，再用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗3次，每次约5 min。冲洗结束后，擦干切片组织周围水分，用特制免疫组织化学笔在组织周围画圈，防止抗体扩散。(6)甩干玻片，分别滴加适量已配置好的一抗溶液，再将切片放置于湿盒中，室温下孵育90 min。其中PD-L1抗体购自Cell Signaling公司(Cat#13684，1∶200)；P40为即用型抗体，购自福州迈新生物技术开发有限公司(Cat# RAB-0666)；其余抗体为即用型抗体，购自DAKO公司，包括广谱细胞角蛋白(pan-cytokeratin，pan-CK)(Cat# GA053|IR053)、CK5/6(Cat# GA780|IR780)、白细胞共同抗原(leukocyte common antigen,LCA)(Cat# GA751|IR751)、突触素(synaptophysin,Syn)(GA660|IR660)、Ki-67(Cat# GA626|IR626)。(7)使用PBS冲洗3次，5 min/次。(8)甩干玻片，滴加即用型二抗(购自Dako公司)，放置于湿盒中，室温下孵育20 min。(9)使用PBS冲洗3次，5 min/次。(10)将DAB显色剂滴加在切片组织上，静置2～3 min观察显色情况，当阳性对照组织出现棕色时，用自来水冲洗，停止显色。(11)将切片放入苏木素染液复染组织细胞核，约5 min，自来水冲洗，再放入1%盐酸酒精进行分化片刻后用自来水冲洗，再放入返蓝液中返蓝1 min。(12)放入梯度乙醇进行脱水，乙醇浓度依次为85%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、无水乙醇，每次约为1 min；放入苯酚二甲苯、二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)中透明处理3次，每次约3 min；用中性树胶封片。(13)组织PD-L1表达水平以肿瘤比例评分(tumor proportion score,TPS)表示，所有切片由两位病理医师独立判读。PD-L1表达水平以任何强度膜染色的TPS为判读标准，TPS<1%为阴性，TPS≥1%为阳性；TPS 1%～49%为低表达，TPS≥50%为高表达[6]。

1.4原位杂交检测 EB病毒编码的小RNA[Epstein-Barr(EB) virus-encoded small RNA,EBER]原位杂交检测试剂盒购于Dako公司。15例标本均经10%中性福尔马林固定，常规脱水、石蜡包埋、切片、烤片，具体操作步骤：(1)将切片放置于二甲苯中脱蜡2次，每次约5 min。(2)将切片放置于无水乙醇中5 min后晾干。(3)将切片滴加新鲜配制的胃消化酶后放入湿盒中，再放置于37 ℃水浴箱内，40 min。(4)取出切片后放入梯度乙醇，乙醇浓度依次为75%乙醇、85%乙醇、无水乙醇,每次约2 min。取出切片后晾干。(5)混匀探针溶液，每张切片滴加10～20 μl，盖上盖玻片，放入37 ℃水浴箱2 h。(6)取出标本，移去盖玻片，用PBS冲洗，再将切片浸于PBS中3次，每次约5 min。(7)滴加30～50 μl二抗溶液，放入37 ℃水浴箱，30 min。PBS冲洗3次，每次约1 min。(8)滴加50 μl DAB显色液于切片，显色5～10 min，光镜下观察显色情况，适当终止显色。(9)苏木素染色3～5 min，盐酸酒精进行分化片刻后自来水冲洗，再放入返蓝液中返蓝1 min。(10)脱水、透明与封片。

1.5影像学检查 所有患者就诊时进行GE Highspeed 16螺旋CT平扫及增强检查，其中肿瘤位于鼻腔及涎腺的患者均行GE discovery MR 750 3.0 T磁共振仪检查。

1.6随访 通过电话和门诊复查方式进行随访，复查项目包括胸片、B超、血生化及肿瘤标志物等。

2 结果

2.1临床特征 15例LELC中10例发生于肺部，男2例，女8例，中位年龄为58岁。患者仅有轻微咳嗽或胸闷，或体检时发现肺部肿块。胸部CT常显示团块状高密度影，呈分叶状，周围见长短不一毛刺征。1例因发生L3椎体转移，以左膝盖疼痛伴左腰牵拉疼痛为首要症状而就诊。LELC发生于涎腺3例，其中腮腺2例，颌下腺1例。3例患者均因发现无痛性肿块而就诊，专科查体发现肿块呈卵圆形，边界尚清，表面光滑，质地中等偏韧，无波动感，活动度较差，无明显压痛。1例LELC发生于肾盂，为80岁女性患者，患者因无痛性肉眼血尿而就诊，CT提示右侧肾盂-输尿管区见一不规则软组织密度灶，边界欠清，增强扫描明显不均匀强化。1例LELC发生于鼻腔，为79岁女性患者，因无明显诱因出现右侧鼻腔流清水样涕，伴鼻塞而就诊，MRI提示右侧鼻腔占位，考虑鼻息肉或内翻乳头状瘤，右侧额窦、上颌窦炎症，此患者影像排除鼻咽癌转移。见表1。

2.2病理学特征 肿瘤大体为灰白，少部分为灰红或灰黄，质稍硬，与周围组织分界不清。镜下特点：癌细胞呈巢状、弥漫片状或条索状排列；细胞圆形、多角形或不规则，胞质红染，界不清，未分化或低分化状；细胞核深染或呈空泡状，可见明显的核仁及核分裂像；间质伴丰富的淋巴细胞、浆细胞浸润。见图1。

2.3免疫组织化学染色结果 15例LELC病例中，pan-CK、P40均为阳性，除病例2 Ki-67低表达外，其余病例Ki-67增殖指数≥40%。10例样本显示PD-L1膜阳性表达，其中4例PD-L1高表达，TPS≥50%，6例PD-L1低表达，1%

表1 15例患者临床特征

ⓐ肿瘤细胞呈巢团小梁状分布，间质伴丰富淋巴细胞浸润(×100)；ⓑ肿瘤细胞呈卵圆形或多角形(×200)；ⓒ观察可见嗜酸性核仁(×400)

ⓐ肿瘤组织pan-CK表达阳性；ⓑ肿瘤组织P40表达阳性；ⓒ肿瘤组织Ki67高表达；ⓓ肿瘤组织PD-L1强性；ⓔ肿瘤组织Syn阴性；ⓕ背景浸润淋巴细胞表达LCA

2.4原位杂交检测结果 除病例5(病变发生于肾盂)外，其余14例样本EBER均为阳性。见图3。

图3 原位杂交EBER阳性图

2.5随访结果 随访截止日期为2021年5月17日，中位随访时间为12个月。除2例失访外，其余13例术后每3个月进行复查。其中病例8确诊时已发生椎体转移，行化疗治疗，目前带瘤生存，其余12例均无复发转移。

3 讨论

3.1LELC于1987年首次报道，认为其发生与EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染有关[7]。本研究中10例肺部LELC均为EBER阳性。2015年世界卫生组织的肺肿瘤分类中将肺LELC归为其他未分类癌[8]。与常见的肺腺癌、鳞癌相比，肺LELC很少伴有EGFR突变或ALK重排等非小细胞肺癌常见驱动基因变异。Hong等[9]通过对肺部LELC患者肿瘤组织样本进行全外显子测序(whole exome sequencing,WES)、靶向深度测序和单核苷酸多态阵列(single nucleotide polymorphism，SNP)研究，结果发现LELC中一些抑癌基因出现高频突变，包括TP53、NOTCH1、MGA、PTPRD、TRAF3和KMT2C等。TP53变异频率仍然较低，且与患者生存期无显著关联。此外，拷贝数改变也较为常见，如5p(32%)、12p(54%)和12q(48%)扩增；同时也发现3p、5q、13q、9p21.3、14q和16q的频繁丢失，其中9p21.3缺失与患者临床不良预后密切相关，其中涉及CDKN2A、CDKN2B和MTAP抑癌基因。这些染色体缺失导致NF-κB通路的多个负调控因子失活，包括TRAF3[14q32.3，80%]、NFKBIA[14q13，52%]、NLRC5[16q13，52%]和CYLD[16q12.1，48%]等。更重要的是，约56%的病例存在Ⅰ型干扰素相关基因高频缺失，这些基因与宿主对抗病毒感染有关。进一步综合分析显示LELC基因变异谱与NF-κB、JAK/STAT和细胞周期信号通路相关联，并证实EBV感染参与了肺LELC的发病机制。而且，通过多维基因组比较，揭示了肺LELC是一种独特的肺癌亚型，这些改变与鼻咽癌的基因变异谱较为相似。Xie等[10]对27例肺LELC组织样本进行二代测序(next generation sequencing,NGS)分析，其中1例样本未检测出突变，其余26例样本共检测出107个单核苷酸变异、12个插入或缺失和65个拷贝数扩增。仅有2例样本检测出非小细胞肺癌中常见的驱动突变基因，即KRASG12D和ERBB2基因扩增。这项研究发现肺LELC最常见的突变基因包括CCND1、TP53、DAXX和NFκB1A，其发生率分别为30%(8/27)、26%(7/27)、22%(6/27)和22%(6/27)；并且发现FGF19、FGF3、FGF4、MDM4、STAT3和RPS6KB2基因扩增与CCND1或DAXX基因扩增伴随出现。

3.2涎腺LELC常累及腮腺，需与转移性鼻咽癌鉴别，首选影像学检查，且其依然与EBV感染相关[11-12]。发生于泌尿系统的LELC极其罕见，临床症状与一般的尿路上皮癌类似，常以无痛性肉眼血尿为首发症状，与发生在肺部及涎腺的LELC不同的是，肾盂LELC与EBV感染相关性不显著[13-14]。本研究中的1例肾盂LELC也显示EBV阴性，提示可能存在其他恶性转化驱动变异。该患者已随访28个月，目前身体机能良好。有研究表明，尿路上皮LELC预后与常见尿路上皮癌无明显差异[15]。由于尿路上皮LELC来源于尿路上皮细胞的转化，2004年世界卫生组织的泌尿系肿瘤分类中，将LELC归类为尿路上皮癌的一个亚组[16]。发生于鼻腔的LELC必须首先排除存在鼻咽癌，影像学检查是两者主要的鉴别方法。本研究中有1例病变发生于鼻腔的患者，CT检查提示鼻腔占位，但鼻咽部未见明显异常，排除鼻咽癌蔓延或转移可能。

3.3本研究进一步通过免疫组织化学染色法对15例组织标本进行PD-L1检测，结果显示肿瘤中PD-L1膜染色阳性率为66.7%(10/15)，其中4例PD-L1高表达，6例为低表达。近年研究显示，免疫检查点抑制剂对EBV感染相关的胃癌、鼻咽癌、Merkel细胞癌等疗效显著[17-19]。一项包含66例肺LELC的研究发现，约75.8%(50/66)病变组织PD-L1表达阳性，提示肺LELC中EBV阳性且PD-L1高表达可能是免疫检测点抑制剂使用的重要标志物[20]。另一项研究发现，3例PD-L1的TPS分别为15%、30%和60%的LELC患者进行免疫治疗后，均取得良好疗效，提示肺LELC患者可从免疫检查点抑制剂中获益[10]。

综上所述，由于LELC较为罕见，其发生的机制尚未完全阐明，但已有部分研究表明其与EBV感染有关，基因组变异谱与鼻咽癌相似，可能从免疫治疗中获益，预后较好。由于本研究病例数较少，且只进行了免疫组织化学染色及EBER原位杂交检测，尚未进行NGS检测。因此，未来尚需进一步对其确切基因组变异谱进行探讨，为LELC精准诊疗提供新的依据和靶点。