重楼皂苷Ⅰ对人骨肉瘤MG63细胞增殖、凋亡及DNA损伤影响研究

王洪伸,林涌鹏,尹萌辰,常君丽,李欣怡,李永津，陈博来

(1. 广东省中医院，广东 广州 510120；2. 上海中医药大学博士后科研流动站，上海 201203；3.广东省中医院博士后科研工作站，广东 广州 510120；4.上海中医药大学附属龙华医院，上海 201203)

骨肉瘤是一种起源于骨间叶细胞的原发性恶性骨肿瘤，其血行转移发生早且发生率高，进展迅速。该病临床治疗以化学治疗、外科手术、骨重建等方法为主，目前患者5年总体生存率由过去的20%左右提高到55%～75%[1-2]，但化疗药物毒副作用大、耐药性高，因此迫切需要发现新型低毒高效的抗癌药物[3-4]。DNA损伤修复是维持细胞活性的重要机制，当细胞DNA损伤后不能及时修复，损伤积累可能导致基因组不稳定性升高、细胞增殖和分化失控[5]。因此，通过诱导骨肉瘤DNA损伤，或抑制骨肉瘤DNA修复，或开发针对性靶向DNA损伤修复酶抑制剂，对骨肿瘤治疗具有重要意义[6]。中药重楼性微寒，味苦，有小毒，归肝经，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效，用于痈疮、咽喉肿痛、毒蛇咬伤等症。现代研究表明重楼具有较强抗肿瘤作用，其中重楼皂苷Ⅰ是皂苷类主要成分之一，对鼻咽癌[7]、肝癌[8]、肺癌细胞[9]、胃癌[10]等均有抑制作用，但对骨肉瘤细胞作用报道较少。本研究在团队前期基础上进一步探索了重楼皂苷Ⅰ诱导DNA损伤及潜在分子机制。

1 实验材料与方法

1.1细胞株和培养 人骨肉瘤MG63细胞株购自中国科学院上海细胞库。将MG63细胞接种于含有10%FBS、100 μg/mL链霉素、100 IU/mL青霉素的MEM培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中饱和湿度培养下培养扩增，每2～3 d使用含有0.25%EDTA的胰酶消化细胞传代。

1.2主要药物、试剂及仪器 重楼皂苷Ⅰ购自上海经科化学有限公司(CAS No.50773-41-6，纯度98%)；MEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，台盼蓝染色液、TUNEL试剂盒、DAPI、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、RIPA裂解液试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、BeyoECL Plus显色液购自上海碧云天生物技术公司,正常熔点琼脂糖购自德国Biofroxx公司，低熔点琼脂糖购自美国Amersco公司,溴化乙锭购自美国Sigma公司,三羟甲基胺基甲烷、盐酸(HCl)、氢氧化钠(NaOH)、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、碱性电泳缓冲液(pH=13)购自上海国药集团,PBS来自瑞典Medicago公司,Bcl-2抗体、Bax抗体、PARP抗体来自美国Cell Signaling Technology公司，β-actin抗体来自美国Sigma公司，PVDF膜来自NEN Life Science公司,Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate化学发光显色试剂盒来自美国Thermo公司,6孔、12孔、24孔、96孔细胞培养板来自美国康宁公司,离心机、酶标仪、Scientific Forma SeriesⅡ CO2细胞培养箱购自美国Thermo Fisher公司，EMLBSLR显微镜购自日本Leica公司，BH-20光学显微镜购自日本Olympus公司。

1.3细胞存活率检测 实验分为PBS对照组、0.625 μmol/L重楼皂苷Ⅰ组、1.25 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组，每组3个复孔。取对数生长期MG63细胞，0.25%胰蛋白酶消化，以浓度2×104/孔接种到24孔板(500 μL)，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，然后每组相应加入PBS、0.625 μmol/L重楼皂苷Ⅰ、1.25 μmol/L重楼皂苷Ⅰ孵育72 h，0.25%胰蛋白酶消化离心，吹散细胞后取悬浮细胞液30 μL与0.2%台盼蓝染液30 μL混合均匀，染色5 min，取20 μL加入Countstar细胞计数仪计算分析实验结果，包括总细胞数、活细胞数、死亡细胞数及细胞存活率。

1.4划痕实验检测 实验分为PBS对照组、0.625 μmol/L重楼皂苷Ⅰ组。将MG63细胞以1.5×105/孔(500 μL)接种至12孔板中培养24 h，检视单层细胞融合度达到90%，用无菌PBS清洗2次。每孔添加800 μL无血清MEM培养基饥饿处理12 h。用无菌的200 μL枪头在单层培养细胞划痕，加入0.625 μmol/L重楼皂苷培养基培养0 h、24 h、48 h、72 h，每隔24 h在同一视野拍照，如细胞漂浮较多影响观察更换无培养基。结束后使用Image J 软件对照片分析，将500pix定义为1 cm，测量间隙距离，每张照片测量15次，进行统计学分析。

1.5细胞凋亡流式细胞术检测 实验分为PBS对照组、0.625 μmol/L重楼皂苷Ⅰ组、1.25 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组，另设非染色细胞组、Annexin V-FITC染色细胞组、PI染色细胞组用于调节补偿，每组3个复孔。将细胞以浓度1.5×105/mL，800 μL接种到12孔板培养2 h后将每孔培养基弃除，无血清MEM培养基饥饿处理12 h，每组加入PBS和相应浓度重楼皂苷Ⅰ干预24 h，收集细胞。依照碧云天生物技术研究Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(C1063)说明书操作步骤，BD Accuri C6流式细胞仪检测细胞凋亡情况，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

1.6细胞DNA损伤TUNEL法检测 实验分为PBS对照组、0.625 μmol/L重楼皂苷Ⅰ组、1.25 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组。取对数生长期MG63细胞，经胰酶消化重悬浮，调整细胞浓度为1×104/孔接种于48孔板(500 μL)，每组设3个复孔，每组相应加入PBS、0.625 μmol/L重楼皂苷Ⅰ、1.25 μmol/L重楼皂苷Ⅰ孵育48 h后收集样品，按照碧云天试剂盒说明书步骤操作，在荧光显微镜下观察并计算TUNEL/DPAI荧光值。

1.7细胞DNA损伤彗星实验检测 分组同“1.6”，彗星实验采用三层凝胶结构，第一层为正常熔点琼脂糖，第二层为低熔点琼脂糖和细胞核悬浮液的混合层，第三层为低熔点琼脂糖，制备好玻片后，分别移去每组细胞盖玻片，将载玻片浸入新配置的细胞裂解液中，4 ℃裂解90 min，然后将载玻片置于另一器皿中，倒入新配置的碱性电泳缓冲液，没过胶面，碱解旋20 min；继续进行单细胞电泳：将载玻片转移到电泳槽中，通过调节电泳液高低，使电压、电流稳定在25 V、300 mA，电泳10～15 min结束后，每片载玻片上滴加100 μL 30 μg/mL的溴化乙锭溶液，避光染色10 min后在荧光显微镜下观察并拍照。对每张玻片所载细胞利用Comet Assay Software Pect (CASP 1.2.3 beta 1) 慧星分析软件分析结果照片计算尾部和总慧星荧光百分比(TailDNA%)。根据TailDNA%将细胞DNA损伤程度分为5级，比较各组损伤分级。0级：无损伤(正常细胞)，TailDNA%<5%；1级：低度损伤，TailDNA% 5%～20%；2级：中度损伤，TailDNA% 20%～40%；3级：重度损伤，TailDNA% 40%～90%；4级：完全损伤，TailDNA%>95%。

1.8损伤相关蛋白Western blot法检测 取对数生长期MG63细胞,分别接种至6孔板，分别予1.25 μmol/L重楼皂苷Ⅰ处理0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、3 h、6 h后收集蛋白样品，加入400 μL RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃条件下12 000 r/min离心(离心半径8.4 cm)10 min，提取细胞总蛋白。采用BCA法检测蛋白浓度。蛋白样品中加入5×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液，沸水煮10 min，蛋白变性。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白，将分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜，封闭2 h，将Bax、Bcl-2、Cleaved PARP一抗稀释(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，加入二抗稀释液(1∶5 000)，TBST洗涤，滴加ECL，暗室内曝光显影，检测Bax、Bcl-2、Cleaved PARP蛋白表达情况。

2 结 果

2.1MG63细胞存活率比较 PBS对照组、0.625 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组和1.25 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组细胞存活率分别为(97.51±0.51)%、(68.84±1.80)%、(34.33±2.23)%，0.625 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组和1.25 μmol/L重楼皂苷Ⅰ组细胞存活率均明显低于PBS对照组(P均<0.05)，且1.25 μmol/L重楼皂苷Ⅰ组明显低于0.625 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组(P<0.05)。

2.2MG63细胞迁移能力比较 PBS对照组和0.625 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组划痕初始宽度比较差异无统计学(P>0.05)，培养24 h、48 h、72 h时0.625 μmol/L重楼皂苷Ⅰ组的划痕宽度均大于PBS对照组(P均<0.05)。见图1及表1。

图1 2组MG63细胞培养不同时间细胞迁移情况(×100)

表1 2组MG63细胞培养不同时间细胞迁移能力比较

2.3MG63细胞凋亡率比较 PBS对照组、0.625μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组和1.25 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组细胞凋亡率分别为(2.56±0.20)%、(19.58±3.09)%、(66.08±4.02)%，0.625 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组和1.25 μmol/L重楼皂苷Ⅰ组均明显高于PBS对照组(P均<0.05)，且1.25 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组明显高于0.625 μmol/L重楼皂苷Ⅰ组(P<0.05)。见图2。

图2 各组MG63细胞凋亡流式图

2.4MG63细胞TUNEL/DPAI荧光值比较 PBS对照组、0.625 μmol/L重楼皂苷Ⅰ组和1.25 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组TUNEL/DPAI荧光值分别为0.03±0.01，0.15±0.01，0.28±0.01，0.625 μmol/L重楼皂苷Ⅰ组和1.25 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组均明显高于PBS对照组(P均<0.05)，且1.25 μmol/L重楼皂苷Ⅰ组明显高于0.625 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组(P<0.05)。见图3。

图3 TUNEL法检测各组MG63细胞 DNA损伤情况(×100)

2.5MG63细胞DNA损伤率比较 PBS对照组、0.625 μmol/L重楼皂苷Ⅰ组和1.25 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组细胞TailDNA%分别为(1.87±0.78)%、(14.12±4.75)%、(28.9±8.78)%，损伤分级分别为0级、1级、2级，0.625 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组和1.25 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组细胞DNA损伤率均明显高于PBS对照组(P均<0.05)，且1.25 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组明显高于0.625 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组(P<0.05)。见图4。

图4 彗星实验检测各组MG63细胞DNA损伤情况(×100)

2.6凋亡相关蛋白表达水平比较 1.25 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ培养0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、3 h、6 h后，Bax、Cleaved PARP蛋白表达随时间延长而逐渐增高，Bcl-2蛋白表达逐渐降低。见图5。

图5 1.25 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ培养不同时间后MG-63细胞凋亡相关蛋白表达情况

3 讨 论

古代中医文献中，骨肉瘤属于“骨瘤”“骨疽”“石疽”“石痈”等范畴。《灵枢·刺节真邪》曰：“有所结，深中骨，气因于骨，骨与气并，日以益大，则为骨瘤。”《外科枢要》云：“若伤肾气，不能荣骨而为肿者，其自骨肿起，按之坚硬，名曰骨瘤。”《医宗金鉴》云“痈疽原是火毒生，经络阻塞气血凝”，并谓“茧唇”(唇癌)乃“脾胃积火”积聚而成。“失荣”由“忧思恚怒，气郁血逆，与火凝结而成”。《古今医统》亦指出：“气血日亏，相火渐炽，几何不致噎膈。”临床发现瘀热火毒与肿瘤常并存，转移性肿瘤中、晚期常伴有病灶局部青紫、瘀斑、瘀点、灼热、五心烦热、口渴尿赤、便秘、舌质暗苔黄腻等瘀热证候。上海中医药大学骨伤科名家施杞教授凝练总结肿瘤患者晚期“气虚血瘀、瘀阻化热”的病因病机特点，提出“益气化瘀、清热解毒”治疗原则，精心研制抗肿瘤国家新药—芪珍胶囊(珍珠、黄芪、三七、大青叶、重楼)，能够有效抑制肿瘤进展，缓解症状。本研究从DNA损伤角度研究了其中重楼有效组分重楼皂苷Ⅰ对骨肉瘤的抑制作用，进一步探索传统药物抗肿瘤效应的优势。

本团队前期研究发现重楼皂苷Ⅰ能够抑制多种骨肉瘤细胞活性并促进其凋亡，其机制包括抑制NF-κB和内质网未折叠蛋白反应信号通路活性、上调细胞周期相关蛋白(C-Myc、cyclin B1、cyclin D1)表达和促凋亡相关蛋白(Bax、Cleaved PARP)表达、下调抗凋亡Bcl-2基因表达等[11-12]。此外重楼皂苷能够抑制肺腺癌细胞A549、NCI-H1299增殖，下调cyclin B表达[13]，可抑制胃癌细胞PDK1/Akt/mTOR信号通路活性[14]，诱导乳腺癌细胞线粒体紊乱而使细胞凋亡[15]。重楼皂苷Ⅰ抗肿瘤作用机制广泛，涉及细胞增殖、凋亡、生长、分化等多个细胞进程，但其造成DNA损伤的具体结构和靶点尚不清楚。本实验结果证实，重楼皂苷Ⅰ能促进MG63细胞凋亡，可诱导骨肉瘤细胞产生DNA损伤，PARP作为凋亡标志酶可能参与其中关键过程，但仍需进一步深入探索。

综上所述，DNA损伤可引起细胞周期阻滞、凋亡、衰老、自噬等，是抗肿瘤药物开发的重要策略。重楼皂苷Ⅰ能诱导骨肉瘤细胞DNA链断裂，抑制骨肉瘤MG63细胞增殖、迁移，促进细胞凋亡，具体机制可能与DNA-PKcs相关，或与组蛋白甲基化修饰有关，如何对其进行化学修饰具有靶向功能、或与化疗药物联合应用提高复发/难治性骨肉瘤的疗效尚需深入探讨。此外，DNA损伤在诱导肿瘤细胞死亡同时，也可能导致正常细胞异常增殖或癌变，在研究中需要注意。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。