粳稻种质资源籼粳属性鉴定及其对表型性状的影响

周慧颖，余丽琴，刘 进，胡佳晓，黎毛毛

（江西省农业科学院 水稻研究所/江西省农作物种质资源研究中心，江西 南昌 330200）

【研究意义】长期以来，华南稻区以籼稻生产为主，东北稻区以粳稻生产为主，长江中下游沿江地区为籼、粳稻混栽区[1-2]。近年来，城市化的发展推动了南方城市粳米的消费，由于粳稻的耐寒性好、耐肥抗倒且增产潜力大，适合机械化生产，加之长江中下游沿江地区具有种植粳稻的传统和自然条件，恢复粳稻生产已成为该区域水稻转型生产的战略选择[3-5]。但非江西省培育并大面积推广的优质高产常规粳稻品种不适应江西省水稻高温生长环境，种植中表现生长量小、品质下降明显[6]。因此，江西省发展粳稻生产急需本土化的优质粳稻品种。实践证明，基于籼稻和粳稻亚种间的杂交育种理论，利用籼粳杂种优势[7]不仅能够提高粳稻的产量，对丰富粳稻的遗传构成也有重要意义[8-10]。因此，有必要利用高效的分子标记技术，分析检测品种的籼型或粳型基因频率与籼粳分类属性，为育种与判定品种的类别提供理论指导。【前人研究进展】籼稻品种9311 和粳稻品种日本晴全基因组测序的完成，为建立基于InDel 分子标记的籼粳分类方法提供了重要工具[11-14]。王林友等[15]通过InDel 分子标记法鉴别了育种上常用的48 份籼粳及中间型材料的籼粳属性，并运用程式指数法对其准确性进行了验证，证明了In-Del 分子标记在稻种资源籼粳属性鉴定上的可行性。王明军等[16]利用34 对InDel 分子标记对来自云南的181 份糯稻品种进行籼粳属性分析，再次表明InDel 分子标记法能快速高效的鉴定云南糯稻品种的籼粳属性。【本研究切入点】在江西省实施晚稻“籼改粳”，既有利于提高日干物质产量的积累和稻米品质，又有利于充分利用后期光、温等土地利用资源的充分利用，提高了土地综合利用效率。同时，也可以适当延长双季稻中早稻生长的周期，早稻种植中迟熟的品种，提高双季早稻的生产率，进而达到双季高产[8]。随着我国水稻籼粳属性分析技术的不断完善，目前有关稻种资源的籼粳鉴定工作已取得长足的进展，但主要集中在部分地区资源的鉴定，其研究结果具有一定局限性，真正用于水稻品种鉴定与评价方面报道较少，尚未对适合江西省稻种资源的籼粳分化水平及籼粳基因频率与表型性状的相关性进行深入研究，籼型血缘的引入在提高产量的同时是否会对其品质有负面影响也需要进行深入探讨。【拟解决的关键问题】本研究利用30 对InDel 籼粳特异性标记对来自国内外收集和引种的360 份优异粳稻资源进行籼粳属性鉴定，并调查其田间表现、产量和品质等8 个表型性状，分析籼型基因频率与表型性状两者之间的相关性，并结合株型、产量、品质等性状，最终筛选出123 份粳稻种质作为江西省“籼改粳”育种核心种质资源，为有效合理利用粳稻资源以及改良水稻品种提供了理论依据及育种材料。在江西省大力发展粳稻生产，提高粳稻的总产量及其品质，对于保证江西省人民“口粮”安全和维护社会稳定具有重要战略意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为2016—2019 年收集的1 617 份国内外粳稻资源，在江西省南昌、宜丰、上饶、抚州、萍乡5个地区进行多年多点的适应性初步鉴定后，筛选出生育期适宜和株高适中的优异粳稻种质资源360份，包括北方粳稻、长江中下游优质粳稻、云贵川高原粳稻、日本优质粳稻等（图1），以日本晴和9 311分别作为典型粳稻和典型籼稻的对照品种。

图1 360份粳稻种质资源分布情况Fig.1 Geographical distribution of 360 japonica rice germplasm resources

1.2 田间试验设计及统计

试验材料于2019 年在江西萍乡试验基地种植，采用随机区组设计，3 次重复，每区8 行，每行28 株，株行距16.5 cm×26.4 cm，双本插。5 月21 日播种，6 月16 日移栽，田间管理同常规水稻大田生产。调查单株有效穗数（个）、穗长（cm）、每穗粒数（粒）、结实率（%）、千粒质量（g）、理论产量（t/hm2）、粒长（mm）和粒型（长宽比），具体调查方法按照韩龙植等[17]主编的“水稻种质资源描述规范和数据标准”。所有表型性状数据使用Excel 2010 软件处理和绘制图表，用SPSS20.0 计算其均值、标准差、方差和变异系数并进行相关分析。

1.3 基因组DNA的提取和分子标记分析

在每个品种中间行取幼苗的嫩叶2 片，采用CTAB 法[18]分别提取各基因组DNA。参考卢宝荣等[19]选择均匀分布于l2条染色体且具有较高籼粳特异性的34对InDel分子标记，委托江西鼎国生物科技有限公司合成。PCR 扩增体系参考刘进等[20]的方法，选择10 μL反应体系，PCR 产物利用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，电泳完毕硝酸银染色后作带型分析。

1.4 数据分析

以典型籼稻9311和典型粳稻日本晴DNA的PCR 电泳结果为对照，在各InDel位点上，样品电泳条带位置与9311 位置一致的，记为纯合籼稻基因型（II）；样品电泳条带位置与日本晴一致的，记为纯合粳稻基因型（JJ）；样品电泳条带位置出现既与籼稻9311 位置相同又同时与粳稻日本晴条带置相同的，记为籼/粳稻杂合基因型（IJ）。根据所有InDel 位点上各样品的基因型数据来计算其籼粳基因频率（F），计算公式[21]如下：

式（1）（2）中，Xii为纯合籼稻基因型（II），Xjj为纯合粳稻基因型（JJ），Xij为籼粳稻杂合基因型（IJ），N为籼粳特异InDel 分子标记数目。根据被检测样品在多个InDel 位点上的籼粳基因频率，参照栽培稻籼粳属性的判别标准（表1）来判定参试品种的籼粳属性[21]。

表1 按照籼型（Fi）或粳型（Fj）基因频率鉴定籼稻或粳稻的InDel分类标准Tab.1 InDel classification standands based on indica（Fi）gene frequencies and japonica（Fj）gene frequencies

为了检测各样品由InDe1 分子标记所揭示的遗传亲缘关系，以“0，l”建立统计数据库，每一对InDel分子标记检测一个位点，每一条多态性条带为一个等位基因，在相同位置上，有带记为“1”，无带记为“0”，条带缺失记为“9”。同时以InDel 条带赋值为变量，用统计分析软件SPSS25.0 对各样品数据库进行主成分分析（principal componentanalysis，PCA），获得所有研究材料各主成分的特征向量值，然后用Excel软件依据第一和第二主成分的特征向量的平均分量值作平面散点图。

2 结果与分析

2.1 供试材料的籼粳等位基因频率和属性鉴定

筛选出在扩增粳稻种质资源时带型分化明显的30对InDel分子标记，360份粳稻种质资源均可扩增出2 条特异性条带，含3 种带型，即籼稻特异性条带（II）、粳稻特异性条带（JJ）和籼粳杂合型条带（IJ），说明筛选出30对InDel引物具有较强的籼粳特异性。计算每份资源的籼稻型基因频率（Fi），并按照表1进行资源的籼粳属性分类，结果表明，在360 份粳稻种质资源中，籼型成分集中分布于0～10%，有典型粳稻312 份，占86.67%；粳稻42 份，占11.67%；偏粳5 份，占1.39%；偏籼1 份，品种盐恢559（图2）。因此，所鉴定的粳稻种质资源中基本都是含有粳型基因频率的粳型稻（典型粳稻、粳稻和偏粳），这些品种没有或引入了极少量的籼型血缘。

图2 360份粳稻种质资源的籼型基因频率分布情况Fig.2 Indica gene frequency of 360 japonica rice germplasm resources

2.2 供试材料的主成分分析

根据30对InDel分子标记扩增条带建立的数据库，对360份粳稻进行主成分分析（图3），依据各参试材料第一主成分和第二主成分的向量值作平面散点图。其中，第一主成分对遗传变异的贡献率为53.28%，第二主成分为14.90%，累积贡献率为68.19%，代表主要的遗传变异。图中每一个点代表一个参试材料，以各试验材料在散点图中的空间位置来推断它们之间的遗传亲缘关系，PCA 散点图结果和籼粳属性鉴定结果高度一致，360 份试验材料被聚集到2 个不同的区域，●区为粳稻区，对应着358 份含有粳型基因频率的粳型稻（典型粳稻、粳稻和偏粳），◆区为籼稻区，对应着偏籼品种盐恢559，区域大小反映的是区域内材料变异的水平，区域空间距离反映的是遗传距离的远近。

图3 360份粳稻种质资源的主成分分析散点图Fig.3 The scatter plotting of principal component analysis(PCA）of the 360 japonica rice germplasm resources

2.3 数量性状表型变异情况

由表2可知，360份粳稻种质资源的8个表型性状均存在不同程度的变异，其中每穗粒数（24.26%）的变异系数最高，谷粒长的变异系数（5.45%）最小，其它6个性状的变异系数（10.09%～18.66%）。所调查的8个性状表型的变异系数均在5.00%以上，表明360份粳稻种质资源表型性状的变异较大，其表型多样性极其丰富。

表2 360份粳稻种质资源数量性状的变异情况Tab.2 Variation of quantitative characters of 360 japonica rice germplasm resources

2.4 籼型频率与产量相关性状的关系

以360份粳稻种质资源的籼型基因频率与6个产量性状进行相关分析，从图4可以看出，在籼粳属性方面，籼型基因频率与穗长、每穗粒数均呈极显著正相关；与单株有效穗数呈极显著负相关，与理论产量和千粒质量呈显著负相关；与结实率无显著相关性。因此，引入籼型血缘对粳稻品种的产量性状有着显著的影响。

图4 籼型频率（Fi）与产量性状的关系Fig.4 Relationship between indica gene frequencies（Fi）and yield traits

2.5 籼型频率与粒型性状的关系

以360份粳稻种质资源的籼型基因频率与2个粒型性状进行相关分析，从图5可以看出，在籼粳属性方面，籼型基因频率与谷粒形状呈极显著正相关，与粒长呈显著正相关。因此，粳稻种质资源的籼粳属性与粒型性状密切相关，在选育不同类型的水稻材料的时应综合考虑。

图5 籼型频率（Fi）与粒型性状的关系Fig.5 Relationship between indica gene frequencies（Fi）and grain traits

3 结论与讨论

3.1 利用InDel分子标记鉴定粳稻种质资源的籼粳属性

确定亲本的籼粳属性、掌握广亲和品种和中间型材料的籼粳分化程度对水稻育种极为重要。基于籼稻和粳稻全基因组插入/缺失位点差异特异开发的InDel分子标记，在鉴定水稻的籼粳属性方面有其明确的分子机制[23-24]。蔡星星等[25]从SHEN 等[26]报道的InDel 分子标记中选择了45 对引物对栽培稻及野生稻进行了检验，结果表明InDel标记可以用于水稻籼粳属性的鉴定。赵伟等[27]利用InDel标记揭示了水稻的籼粳分化机制。徐建欣等[28]利用InDel 标记鉴定了云南陆稻品种的籼粳属性。上述研究表明，InDe1分子标记是一种十分有效可靠的分子标记，可用于测定并分析稻种资源的籼粳属性以及亲缘关系，同时为培育具有亚种间杂种优势的籼粳杂交稻提供了可行的分子技术。

本研究通过均匀分布在水稻基因组12条染色体上的30对InDel标记，对360份适合江西省地区种植推广的种质粳稻种质资源的籼粳属性进行了分析，每对引物均检测到籼稻特异性带、粳稻特异性带和籼粳杂合型条带等3 种带型，计算每份材料的籼稻基因型频率以判定其籼粳属性，360 份粳稻种质资源被判定为典型粳稻、粳稻、偏粳和偏籼4种类型，包括典型粳稻312份、粳稻42份、偏粳型5份、偏籼型1份。可见，籼型成分集中分布于0～10%，所鉴定的粳稻种质资源中基本都是含有粳型基因频率的粳型稻，这些品种没有或者引入了极少的籼型血缘。“粳稻”和“偏籼”这2个不同的群，通过主成分平面散点图在空间上被分隔成2个独立的区域，分与籼粳属性鉴定结果高度一致。

3.2 粳稻种质资源籼粳基因频率与表型性状的相关性

育种研究人员利用籼稻与粳稻进行杂交育种，发挥籼粳亚种间强大的杂种优势，既提高了水稻产量，又丰富了品种的遗传构成，解决了遗传基础狭窄的难题，为水稻新品种选育提供了保障[29]。因此，通过籼稻与粳稻进行杂交育种的方式，“适量”的引入籼稻血缘是培育高产粳稻新品种的有效途径，但是如何把握“适量”的程度，更加有效地发挥亚种间杂交育种的优势，仍需进行深入地研究。为更好地探明“适量”的程度，本研究将360份适合江西省地区种植推广的种质粳稻种质资源的籼型基因频率与8个表型性状进行相关分析，结果表明，除了结实率，其他粳稻种质资源的籼型基因频率与7个表型性状均存在显著或极显著相关，其中，籼型基因频率与穗长、每穗粒数、粒长、谷粒形状呈正相关，与单株有效穗数、理论产量呈负相关，说明粳稻种质资源籼粳属性与表型性状间存在高度的相关性。进一步分析发现，受籼型血缘影响的千粒质量和理论产量基本上都是在Fi≥0.2以后明显增加负向效应；在Fi＜0.2范围内，Fi与千粒质量、理论产量的相关系数或显著水平降低，Fi在0.1左右各性状变异幅度较广，育种选择机会较多。基于此，引入10%左右的籼型血缘可能有利于控制其对粳稻产量的负面作用，在保障粳稻品质的前提下，促进粳稻的产量和品质在更高程度上统一起来。

3.3 江西粳稻育种核心种质的筛选

2008 年以来，江西省政府将“籼改粳”工程作为粮食增产的重要举措，而东北、江浙等地培育并大面积推广的优质高产常规粳稻品种不适应江西省高温生长环境，这些显著差异决定了必须结合本地实际开展核心基础理论和关键应用技术研究，当前江西省发展粳稻生产急需本土化的优质粳稻品种[30]。因此，从国内外粳稻主产区引进粳稻种质资源，积极开展粳稻资源的适应性筛选和鉴定核心育种资源是籼改粳的重要途径。

从籼型基因频率与8个表型性状的相关分析可以看出，Fi＜0.2范围内，Fi与千粒质量、理论产量的相关系数或显著水平降低。因此，为了尽量降低籼型基因频率的负向效应，存在Fi＜0.2 范围内对360 份粳稻种质资源进行筛选，选取出123份粳稻品种作为江西省“籼改粳”育种核心亲本材料。这些粳稻核心亲本材料的籼型基因频率在8%至16%，其中品种农林11、05-0549、靖粳7 号、龙稻16、辽盐283、2014H002、中作9936、镇糯19 号、富禾66、松粳22、中花15 号、辽星3 号、赣榆8286、武运3264、稻花香1号、花117、庄育3 号、宁粳24、辽粳25、龙稻5 号、绥粳1 号、辽盐241、龙粳2 号、沈稻5 号、沈农606、吉农大888、滇靖8 号、九稻68、吉粳502、苏秀10 号、通育401、农林11、龙稻22、中辽9052、丹星稻1 号的结实率和理论产量分别在88%及11 t/hm2以上，特别是品种龙稻5号、绥粳1号、辽盐241、龙粳2号，其产量高达13 t/hm2，而品种松粳22、农林11、绥粳1号、稻花香1号的粒型（长宽比）为2.8以上，达到了籼稻优质米的标准之一。此粳稻育种核心亲本库的构建，解决了目前江西省粳稻生产上存在的问题，尤其是江西省发展粳稻缺乏本土化品种问题，为江西省有效合理利用粳稻资源改良水稻品种提供了理论依据及育种材料，将产生巨大的社会效益。