甘蔗DNA分子指纹图谱研究进展

张慧，林萍萍，黄潮华，黄国强，徐良年，邓祖湖，张木清，赵新旺，，3

（1.福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心，福州 350002；2.广西大学广西甘蔗生物学重点实验室，南宁 530004；3.农业农村部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室，福州 350002）

0 引言

甘蔗是世界第一大糖料作物，广泛分布在100多个国家，全球种植面积有1 900多万公顷，年生产甘蔗约1.45亿t[1]。中国是“甘蔗属复合群”中部分资源的起源地和多样性中心，野生资源十分丰富[2]。我国甘蔗杂交育种起步相对较晚[3]，但也育成了一系列优异甘蔗品种，自实施品种登记制度到2021 年2 月，已有79 个甘蔗品种通过新品种登记。甘蔗基因组庞大，十分复杂，具有非整倍、异源多倍体的特性，功能元件探索和全基因组功能注释工作难度远超大多数作物[4-6]。随着各省、市、自治区对育种持续不断的投入，甘蔗新品种数量将会不断增加。“甘蔗高贵化育种”的后代大量用于栽培种的培育过程，骨干亲本的反复使用，导致新基因资源的缺乏，使得品种间生物学特性差异微小，甚至无法利用表型进行判断[7-8]。

早期，甘蔗品种（系）鉴定依靠观察叶芽外形、茎径等农艺性状，因此受栽培条件与生境影响显著[9]。此外，多数甘蔗品种（系）采用杂交、回交的育种方式，骨干亲本种质资源狭窄，后代遗传变异微小，仅凭形态差异难以区别[10-11]。因此，高效准确地进行品种鉴定对于甘蔗新品种培育推广和知识产权保护等具有重要意义。DNA 指纹图谱技术为品种鉴别和知识产权保护提供了有效手段。本文简述了DNA 指纹图谱的分类及其原理、特点等，概述了目前国内外甘蔗品种（系）分子标记鉴定及指纹图谱的研究进展，并探讨了指纹图谱在甘蔗种质资源区分与育种研究中的应用，以期为甘蔗的品种（系）鉴定及分子身份证建立提供参考。

1 指纹图谱的概念、分类及作用

指纹图谱（Fingerprint）指用遗传标记鉴别生物个体间差异的色谱图或光谱图等[12]。遗传标记主要分为形态、细胞学、生化和DNA 标记[13]，指纹图谱也因此种类很多，主要有化学指纹图谱和生物指纹图谱[14]。

化学指纹图谱是指通过色谱、光谱等方式分析生物个体化学成分特征的图谱[15]。化学指纹图谱在衍生产品的品质及其产地等方面有一定的掌控和识别作用[16]。如：研究表明高效液相色谱法（HPLC-DAD）指纹图谱在红糖质量控制上、产品溯源和功效成分的研究方面具有参考价值[17]；构建甘蔗的HPLC 指纹图谱，对其品种（系）的叶片中药色谱相似度评价具有一定的应用价值[18]。

生物指纹图谱是具有高度的特异性和稳定性，能够鉴别生物个体或群体的图谱[19]。主要应用类型有两种：一种是不受环境影响、由遗传决定的同工酶指纹图谱[20]。如：采用同工酶酶谱分析16 份野生甘蔗‘割手密’，结果显示其遗传多样性丰富，可分为两个大类群，表明云南‘割手密’种类丰富与其变化多样的立体山地环境密不可分[21]。另一种是由英国遗传学家JEFFERYS在1985 年提出的分子标记指纹图谱，即DNA 指纹图谱[22]（DNA Fingerprinting），是对不同品种基因组DNA序列的不同组成和长度进行识别，获得其特有的图纹组成，如人的指纹一样，因此被称为DNA指纹图谱[23]。

DNA 分子指纹图谱作为主要的品种鉴别手段，近几年得到了快速发展。与传统形态及化学区分相比，DNA指纹图谱优势明显：①分子标记数量多，在基因组中广泛分布；②多态性高，存在等位基因变异；③在不同的器官组织和发育阶段都能检测到[24]。如植物种间或种内的不同个体，其所含微卫星序列中的重复单元以及拷贝数可能不同，获得相应图谱也不同[25]。

2 甘蔗DNA分子指纹图谱的主要类型

2.1 用于构建DNA 指纹图谱的常用分子标记特点

分子标记是DNA 指纹图谱的技术基础，常用于DNA 指纹图谱构建的分子标记手段，分别具有如下特点（表1）[26-28]：

表1 构建指纹图谱的主要DNA 分子标记特点Table 1 The characteristics of main molecular markers for building a fingerprint map

2.2 分子标记技术构建指纹图谱在作物分子鉴定的应用

近几年，分子指纹图谱在作物分子鉴定上得到了广泛的应用与发展。KAMBOURIS 等构建马铃薯12 种真菌病原体的RFLP 图谱，并认为该方法将为农业基因组检测提供思路[29]；KAUR 等构建澳大利亚与不同地区大麦麦芽真菌或细菌16sRNA 基因的末端RFLP 图谱，有助于高效鉴别并筛选优质大麦麦芽[30]。ABDELSATTAR等构建3 个埃及大豆品种的RAPD指纹图谱，鉴别得出‘Giza22’品种总酚含量最高[31]；BELLAH等构建15 个小麦品种的RAPD 指纹图谱并筛选到水分胁迫耐受基因型的品种，为小麦抗旱育种提供新思路[32]。SATHYANARAYANA 等构建7 个洲25 个黧豆种质的AFLP 图谱并结合常规农艺性状，有助于鉴别获得合适的改良材料[33]。HE 等筛选出48 对SSR 标记顺利区分了33 个标准品种并构建了指纹图谱，为鉴别烟草新品种提供了可靠的技术支撑[34]；宗凯等顺利筛选出3 组SSR引物成功用于‘C 两优513’和‘深两优5814’的种子纯度鉴定[35]。ZHAO 等用ISSR 引物探讨建立了3 个棉花品种的分子身份证的识别系统及策略[36]；陈志丹等构建ISSR指纹图谱并鉴别了纯种铁观音和变异铁观音茶树品系[37]。TIAN利用SNP构建DNA指纹图谱并成功区分了276个玉米杂交种[38]；郑向华等利用40 个SNP标记鉴定籼粳水稻品种，发现SNP对水稻有很好的鉴别效果[39]。

2.3 分子标记技术构建指纹图谱在甘蔗上的应用进展

目前关于甘蔗品种大规模标准化的分子鉴定鲜有报道，而研究甘蔗遗传多样性可以揭示甘蔗的遗传基础，了解现有种质的遗传背景、遗传结构及品种间的亲缘关系，不仅为高效发掘种质资源重要性状基因打下基础，而且可为甘蔗标准指纹的构建和品种鉴定提供技术支持。

2.3.1 RFLP图谱

RFLP（Restriction fragment length polymorphism）是将样品DNA酶解，再对酶切片段选择性扩增、电泳、利用放射性标记的探针杂交显色分型[40]。CHOWDHURY 等利用RFLP 图谱检测3 个甘蔗栽培品种与其再生体，结果并未发现差异[41]；BESSE等利用RFLP 分子指纹图谱对13 个来自美国和澳大利亚的甘蔗属和蔗茅属材料进行了遗传多样性分析[42]，说明了RFLP标记在甘蔗材料鉴定方面具有很大潜力，但使用放射性同位素，对其应用产生较大阻碍。FERRERO 等结合阴离子交换色谱法构建出适用于八倍体甘蔗的非放射性RFLP指纹图谱[43]，然而，成本较高且步骤依然繁琐。PERERA 等对甘蔗花叶病相关病毒使用RFLP 指纹图谱技术与测序手段分别评估其遗传多样性，指出RFLP标记可靠性较低[44]。

2.3.2 RAPD图谱

RAPD（Random amplified polymorphic DNA）是用随机引物对基因组DNA 进行PCR 扩增，获得不连续的DNA产物的电泳谱带。具有避免放射性污染、简洁易行，无需专门设计引物等优点。TABASUM 等构建了热带种和印度种的40 个甘蔗基因型RAPD 指纹图谱并分析其遗传多样性，该研究对当地甘蔗栽培品种鉴别和种质资源保护具有重要意义[45]。NAWAZ 等依据RAPD 指纹图谱揭示巴基斯坦甘蔗的系统发育关系，为RAPD标记在甘蔗指纹图谱上进一步研究应用提供参考[46]。胡杨等分别构建48 种来自不同国家地区培育的甘蔗品种或亲本材料的RAPD 和SSR 指纹图谱，结果表明SSR 更好地揭示了品种间的遗传多样性和亲缘关系的远近[47]。同时RAPD 技术的缺点也很明显，稳定性差、重复性低，显性标记。因此，RAPD技术在品种鉴定中并未得到广泛使用。

2.3.3 AFLP图谱

AFLP（Amplified fragment length polymorphism）将RFLP 的可靠性和PCR 技术的高效性结合，有多态性强、简单快速和分辨率高的优点。LIMA等根据AFLP指纹图谱率先分析79个巴西甘蔗栽培种的遗传相似性和亲本系数呈显著相关，该结果为进一步量化甘蔗品种间的相关程度和有效区分品种（系）提供新思路[48]。刘家勇等构建了68 份来自澳大利亚、法国、美国和菲律宾的甘蔗AFLP 甘蔗指纹图谱[49]；昝逢刚等采用云南省甘蔗育种研究者筛选出的引物组合对98 份甘蔗种质材料开展AFLP 指纹图谱分析[50]，这些结果都表明AFLP 标记具有多态性高和可靠性好的特点。然而，AFLP 技术要求DNA 质量、纯度较高，需要经过酶切、连接接头、预扩增、选扩增等步骤，过程繁琐，显示的是扩增片段长度的多态性，在区分长度相同而序列不同的DNA片段中存在困难，因此也没有大规模应用。

2.3.4 SSR图谱

SSR（Simple sequence repeat）又称微卫星DNA，是几个（一般为1～6 个）碱基组成的简单串联重复序列，重复单元的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单元序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。SSR 两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列，利用这一特性开发引物，对SSR 位点进行PCR 扩增，即可将区分该位点的不同等位基因/基因型。SSR 标记具有：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，多态性高；(2)多等位基因，信息量大；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；(4)位点明确，引物开发简单，数据共享方便等特点，在植物遗传多样性分析、品种（系）鉴别方面具有良好的应用前景。

PAN 等构建了1 025 份甘蔗种质在21 个SSR 位点的分子身份证库，该结果为美国甘蔗品种鉴定和种质资源的鉴别发挥了巨大作用[51]；刘新龙等借助8对核心引物分析了27个云南自育甘蔗品种（系），并筛选出了3 对高效核心引物，认为SSR 标记可以很好地区分甘蔗品种（系）[52]；NAWAZ 等利用50 个SSR 标记对40 份商业甘蔗材料进行遗传距离和聚类分析，认为SSR 指纹图谱可以帮助甘蔗育种者们明确商用甘蔗品种的遗传谱系和提高育种方法的评估效率[53]。姚春雪等利用SSR技术构建了67份甘蔗与蔗茅杂交不同世代材料的指纹图谱，探讨了甘蔗品系之间同源关系，认为甘蔗与蔗茅杂交后代存在着较为广泛的遗传分化[54]。陆鑫等利用SSR 标记对滇蔗茅杂交后代材料进行分子鉴定，确认了62 份杂交后代为‘滇蔗茅’真实杂种，表明SSR 标记对‘滇蔗茅’后代群体鉴别效率较高[55]；HAMEED等利用21个SSR 标记对20个巴基斯坦抗感赤腐病甘蔗材料进行指纹图谱和遗传多样性分析，结果发现小部分SSR 衍生出的标记可以帮助识别甘蔗赤腐病抗病和感病品种[56]。刘洪博等以甘蔗骨干亲本为参照，构建了29 份云南甘蔗创新种质的指纹图谱，展现了创新种质与16 份亲本间的遗传基础差异和多样性水平，说明云南依赖高山峡谷的特点分布着许多遗传显著差异的‘割手密’无性系[57]。贺尔奇等用3 对核心引物构建了9 个果蔗品种（系）DNA 指纹图谱且分析了其遗传多样性，3 对引物即可将9个遗传差异较小的果蔗完全区分开，表明SSR 遗传标记在果蔗品种鉴定和分子育种等方面有巨大作用[58]。汪洲涛等分别采用AFLP 和SSR 引物分析了38 个甘蔗新品种的遗传多样性，构建了甘蔗品种（系）的DNA 分子指纹库，15对SSR 标记扩增出的位点为9 对AFLP标记扩增的约二分之一，但多态性比率SSR 标记比AFLP 标记高25.52 个百分点，证实了SSR 标记在甘蔗品种鉴别上具有一定的优越性[59]。SIRAREE等分别利用EST-SSR引物和SSR引物对92个印度亚热带甘蔗材料进行遗传多样性对比分析，发现两种类型的标记平均条带信息量（Average band informativeness）相近，但EST-SSR范围更大，说明EST-SSR相较SSR 条带差异更显著，可能是分子检测高效工具之一[60]。ALI 等利用21 对荧光标记的SSR 引物对来自甘蔗属和蔗茅属的115 份材料进行了遗传多样性分析，发现SSR 引物在甘蔗属和蔗茅属材料的分子鉴定中仍然具有良好的效果[61]。徐超华等使用SSR 引物15 对在92 份‘割手密’初级核心种质获得331个扩增条带，多态性条带比例100%，说明了该SSR标记在核心种质之间遗传多样性十分丰富[62]。SINGH等利用61对多态性SSR 引物对139份甘蔗属、禾本科近缘属和甘蔗栽培品系进行遗传多样性和群体结构评估，结果表明SSR 标记在近缘物种鉴别分析中同样具有良好的效果[63]。周峰等利用80 对SSR 引物对44 个含‘斑茅’血缘的甘蔗回交后代和38 个常规甘蔗栽培种进行聚类分析，结果表明SSR 标记能够很好地区分‘斑茅’杂交高世代材料[64]。赖小群等筛选父本特异性SSR 标记鉴定‘新台糖25号’和‘云蔗29-7’F1代群体的真杂种性，为甘蔗遗传指纹图谱构建和重要性状的QTL 定位提供可靠材料[65]。这些研究表明，SSR 标记可以很好分析甘蔗遗传多样性，也能够用于品种的鉴定，并且具有良好的应用前景。

2.3.5 ISSR图谱

ISSR（Inter-simple sequence repeat）是将SSR 序列的3′端或5′端加上2～4 个随机核苷酸，在PCR 反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA 片段进行PCR 扩增。王英等使用筛选出7 对多态性较强的引物对祖亲种、栽培种96 份进行分析并构建甘蔗ISSR 指纹图谱[66]；黄河星等用ISSR 标记方法分析了甘蔗栽培种与热带种以及‘割手密’之间亲缘关系，说明遗传相似性系数在0.72 以上时，可以将热带种和栽培种归为一类，‘割手密’和‘斑茅’各一类[67]。程琴等利用10 对ISSR 引物对两个甘蔗优良品系进行分析，明确了两个品种存在真实性差异，并得出3对核心引物即可用于鉴别两个品种的结论[68]。ISSR 克服了AFLP 操作相对繁琐的缺点，相较SSR、RAPD 多态性更高，但ISSR 是显性标记，其基因分型确定性的判别上存在弊端，无法区分显性纯合基因型和杂合基因型，因此也没有大规模的应用。

2.3.6 SNP图谱

SNP（Single nucleotide polymorphism）是不同个体核苷酸序列上的单个碱基差异，有置换、插入或缺失等不同的形式。作为第三代分子标记，具有密度高、稳定性强等优点，已被广泛用于作物品种的鉴别。檀小辉等利用甘蔗已公布的EST 序列筛选大量SNP 候选位点，为甘蔗SNP 标记的开发和应用提供一定的参考[69]；GARCIA 等利用分析软件生成的SNP 去分析评估甘蔗商业品种F1后代的倍性和等位基因剂量，促进多倍体作物开发高质量遗传图谱的构建和基因组序列的组装[70]；Axiom Sugarcane 100K SNP 芯片的设计开发与高密度遗传图谱的建立，为甘蔗高效基因分型与指纹图谱的构建起到推进作用[71-72]；MANIMEKALAI等探讨了借助NGS（Next generation sequencing）技术获得SNP 阵列对甘蔗品种改良的作用，促进SNP 标记用于指纹图谱构建和品系鉴别[73]。可见，SNP已广泛应用于甘蔗遗传图谱绘制和数量遗传研究，同时也为甘蔗指纹图谱构建和品种鉴别提供了很好技术基础和方向。

以上列举了最具代表性的6 种分子标记手段，主要基于4 种原理，分别是基于DNA杂交、PCR、限制性酶切和PCR、单核苷酸多态性（SNP）。其中SSR和SNP优势明显、应用广泛，被推荐作为作物品种鉴定和指纹数据库构建的优选标记[74]。分子标记种类很多，用于甘蔗指纹图谱构建的标记还有RAMP[75]，而其它的分子标记如：TRAP[76]、SRAP[77]、SCAR[78]、SCoT[79]、InDel[80]在甘蔗上分别用于遗传多样性分析、功能验证、QTL 定位、品种鉴定、遗传图谱的构建等。而其它开发的标记如：DAMD、BPS、URP、CBDP、iPBS、CDDP、PAAP 等，由于多态性效率低、特异性差、数量有限和开发成本难度高等，当前基本只用于遗传研究，而在分子指纹图谱构建及品种鉴定方面应用较少。目前，随着测序技术的飞速发展，其中KASP（Kompetitive allele-specific PCR）标记已经在水稻[81]、小麦[82]、玉米[83]、大豆[84]等作物上有着大量的研究报道，为甘蔗指纹图谱构建和分子鉴定提供了借鉴。总之，利用分子标记构建甘蔗DNA 指纹图谱为甘蔗品种鉴定和真实性检测提供了一种有效的手段，可为我国蔗种市场规范管理和品种权保护提供技术保障。

3 甘蔗种质分子身份证与指纹图谱库的构建

3.1 甘蔗种质分子身份证与指纹图谱库的构建

标准样品、核心引物和标准程序是构建品种（系）标准DNA 指纹图谱数据库应满足的3 个基本要求。DNA 指纹图谱数据记录的方式多样，其根本都是以电泳带型为基础，对电泳图谱进行数字化编码处理。最常见的形式就是将扩增得到的等位基因进行“0/1”数字化（即根据有无带记为“1、0”），所有标记位点的数据来表示品种的指纹信息，结果简单明了。研究者对数据进行分析和适配，并开发相应的软件，对各个品种的指纹图谱进行收录和整理，极大地方便了新品种、疑似品种的鉴别。目前，我国玉米、水稻两个作物已经完成DNA 指纹图谱建设并投入使用[85]，这些为甘蔗建库提供一定的借鉴。

刘新龙等以组合引物（8对引物随机挑选2对）对27份甘蔗自育材料进行分子鉴定，结果表明MSSCIR16/MSSCIR36是最佳引物组合，能将所有云南甘蔗自育品种区分，而且能将10个主栽品种与云南甘蔗自育品种最有效地区分开，使用国家地区代码和品种的国圃号等数据共同组成云南甘蔗自育品种的“身份证”[86]。叶琳莉利用Visual Fox Pro9.0 对31 份重要甘蔗无性系的SSR 标记分析结果为基础，构建了这31 份材料的分子指纹图谱数据库，实现了对甘蔗SSR 分子指纹数据的管理和处理，能够通过对已有数据的匹配查找，对甘蔗SSR 分子指纹数据进行鉴定检测，从而达到鉴定区分品种的目的[87]。改进Rabin-Karp算法的匹配查找部分，提高了数据处理速度。游倩等利用7个SSR 和8个EST-SSR 作为基础核心引物，构建181份甘蔗种质材料的分子身份证和指纹图谱，该分子身份证由121 位0～1 数字组成，代表了15 对SSR 基础核心引物在该品种中的扩增条带分布情况[88]。此外，研究还根据品种的身份证信息构建了具有查询功能的甘蔗SSR 指纹数据库，该数据库包含了3个基础数据库：引物数据库、品种数据库与DNA 指纹图谱数据库，其中DNA指纹图谱数据库主要包括2 715个0～1 组成的分子ID 和2 715张毛细管电泳图[88]。该研究构建的SSR 指纹图谱数据库，具有可查询品种（系）基本信息、品种（系）分子身份证和品种（系）间相似率等基本功能。这些研究为标准甘蔗分子指纹图谱数据库的构建和管理提供了一定借鉴。

3.2 构建甘蔗标准指纹图谱（库）并执行行业标准，保护品种权益

从我国开始受理农业植物新品种权申请，至今已有22 年。截至2020 年10月底，农业植物新品种权申请3.9 万件左右，授予品种权1.5 万件以上，品种保护从无到有，取得了较好的发展[89]。根据农业农村部科技发展中心2021年7月28号公布的数据，2021年1—5月，新公布的植物新品种权数量达到1 302件[90]。数量庞大的植物新品种也为品种权保护工作带来了巨大压力。

目前，我国加入的是1978版国际植物新品种保护联盟（UPOV），未涉及派生品种鉴定的问题。但随着甘蔗育种进程的推进，派生品种鉴定将成为一大挑战，而DNA 分子指纹图谱有望解决这一难题。如果将每个甘蔗品种（系）扩增出的电泳图谱转换成可视化编码，建成主要品种（系）DNA 指纹图谱数据库，利用大数据、人工智能等进行智能流畅的管理，可为甘蔗品种系统鉴别提供基础数据支持。同时，标准DNA 指纹图谱库将在真伪鉴定及品种（系）纯度检验、亲缘类群划分、品种侵权案件的法律依据等方面发挥着巨大的作用。

2013 年以来，农业农村部审定通过高粱、甘蓝型油菜、大麦等16 个农业植物品种DNA 指纹图谱鉴定技术规程的农业行业标准，为构建甘蔗标准指纹图谱提供了借鉴和指导[91]。2018 年农业农村部也对甘蔗登记品种DNA 指纹图谱鉴定技术规程的农业行业标准进行立项，由国家甘蔗工程技术研究中心负责制定，2021年4月正式发布。2019年农业农村部也启动了甘蔗DNA 指纹图谱库的构建工作。利用SSR 分子标记，构建涵盖我国全部国家级、省级无性系品种和获植物新品种权保护的甘蔗品种（系）的分子指纹图谱，对甘蔗种质资源评价、品种鉴别、品种权益保护等具有重要意义。

4 构建甘蔗标准指纹图谱的思考与展望

目前，DNA 指纹图谱技术推动了甘蔗育种的进程，但仍有一些问题亟需思考与解决。在监控方面：第一，国家区试和省级区试、省间区试的协调关系。当同名更换、仿冒雷同甘蔗品种（系）发生在不同省区试之间时，必然涉及协调不同试验管理部门工作关系。第二，品种命名的非唯一性。由于品种（系）名称不唯一，容易出现同一品种利用不同名字或者不同品种利用同样名字在多省（区）审定的情况，为品种管理带来混乱，因为很难核实是育种单位自己对同一品种取了不同的名字，还是盗用他人品种带来混乱。在检测方面：第一，实验误差较大，检测过程繁琐。如SSR 标记，在PCR 结束后PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）中有银染显色等危险繁琐步骤，且人工读带使实验结果偏主观。第二，缺少标准指纹图谱。相较其他作物，基于SNP 标记分型技术的甘蔗分子指纹图谱鲜有报道，而使用SSR 所构建的指纹图谱报道虽多，但由于缺乏统一的引物、标准的实验流程，因此指纹图谱的唯一性较差。针对上述提到的问题，提出以下两点建议：①建立甘蔗品种DNA 指纹鉴定标准试验体系，采用统一的DNA 提取方式、核心引物组合、PCR 扩增反应程序和反应体系，以及使用毛细管电泳荧光检测方式避免人工读带的误差；②建立适应复杂多倍体甘蔗品种的标准指纹数据库管理系统，不断健全数据种质信息表和种质库品种代码信息，实现品种查询和真伪鉴定。