藏产耳柄蒲儿根总酚抗肝癌细胞氧化损伤能力研究

庞海月 ，吴黉坦 ，张书迪 ，黄立森 ，旦真次仁 ，陈芳芳 ，王贵弘 ，陈煜沛 *

（1.厦门医学院天然化妆品福建省高校工程研究中心，福建厦门361023；2.厦门医学院公共卫生与医学技术系，福建厦门361023；3.林芝市科技局，西藏林芝350309）

随着医疗健康事业的发展，越来越多的研究表明机体衰老跟体内自由基增加造成的氧化应激与炎症反应有关，而植物、动物和微生物来源的天然活性产物是抗氧化物质的重要来源［1］。我国的西藏地区植被资源丰富，有较多尚未开发的植物，其中千里光属植物具有重要的药用价值，多次被报道［2］。耳柄蒲儿根［Sinosenecio euosmus（Handel-Mazzetti）B. Nordenstam］属于菊科蒲儿根属二年或多年生草本植物，主要分布在我国的西藏、陕西、甘肃、四川、湖北以及云南等地；海拔2400～4000 米的高山草甸或山体的坡地上经常见到，花期7 月到10 月。王彩芳等［3］2013年对河南产菊科千里光属蒲儿根（S.oldhamianus）的花的成分做了初步研究，从中首次分离到了β-谷甾醇、棕榈酸、泽兰素、Euparone、金丝桃苷和咖啡酸。王春明［4］等人从千里光中分离得到了一个新的倍半萜，研究了其对人肝癌细胞系SMMC-7721和人卵巢癌细胞系HO-8910的细胞毒性、端粒酶活性、凋亡以及相关基因表达的影响。但对于耳柄蒲儿根萃取物抗氧化方面未做较深入的系统研究。据了解，西藏林芝地区民间常采集耳柄蒲儿根花蕾，碾碎，用清水熬煮成膏状后，涂抹于面部，可有效改善皮肤色泽，修复紫外线晒伤。因此对其花蕾进行抗氧化和美白方面的研究，期望将其开发成具有抗氧化以及美白等功效的天然化妆品提取物。

本次试验采用耳柄蒲儿根经大孔树脂富集的组分为研究对象，测定了其酚类物质含量、总抗氧化能力、清除DPPH 自由基和清除NO 自由基能力，并利用对乙酰氨基酚诱导的HepG2 细胞模型检测其对细胞氧化损伤修复的能力。

1 仪器与试剂

1.1 试验仪器

FDU-1200 冷冻干燥机（EYELA 东京理化器械株式会社）；R-300 旋转蒸发仪（BUCHI 日本东京理化器械株式会社）；SpectraMax i3x 酶标仪（美国MD Electronics 公司）；Secura 225D-1CN 电子天平（上海赛多利斯贸易有限公司）；BB150 CO2细胞培养箱（中国赛默飞世尔科技有限公司）；DMI1 倒置显微镜（上海徕卡显微系统贸易有限公司）；AC2-4S1 生物安全柜（新加坡艺思高科技有限公司）；GR85DF全自动高压灭菌锅（厦门致微仪器有限公司）。

1.2 试验药材与试剂

耳柄蒲儿根采自林芝市米林县；人肝肿瘤细胞株HepG2购买于中国科学院典型培养物细胞库。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、L-抗坏血酸（Ascorbic Acid，VC）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐［3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT］，国药集团化学试剂有限公司；没食子酸、对乙酰氨基酚（4-Acetamido-phenol，APAP），生工生物工程有限公司；总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS法）和一氧化氮含量检测试剂盒，碧云天生物科技有限公司。水溶性维生素E，上海西格玛奥德里奇贸易有限公司。

2 方法

2.1 萃取物制备

准确称取100 g 耳柄蒲儿根粉，加入纯水（液料比5：1），70℃水浴萃取，辅助超声波1 h，过滤后经减压旋转浓缩至褐色膏状。经纯水重新溶解后，滤纸过滤，过滤液经大孔树脂AB8 吸附，保留50%乙醇溶剂洗脱液，冷冻干燥后得到耳柄蒲儿根萃取物（Sinosenecio euosmus（Handel-Mazzetti） B. Nordenstam extracts，SEE），4℃冰箱保存备用。

2.2 总酚含量测定

标准曲线：没食子酸水溶液，设置其浓度梯度为0.5、025、0.125、0.0625、0.03125、0 mg/mL。取2根试管，分别加入500µL 不同浓度没食子酸标准溶液和 SEE，加入 500 µL 福林酚试剂，室温静置 5 min。依次加入500µL 10%Na2CO3溶液和350µL ddH2O，混和均匀，避光反应1 h，测定760 nm 处各吸光值并计算总酚含量，单位为µg GAE/mg。计算标准曲线方程：Y=31.31X+0.059 45（R2=0.994 2），方程中X为没食子酸浓度，Y为OD值。

2.3 总抗氧化能力测定

依照ABTS试剂盒使用说明书，水溶性维生素E标准溶液设置浓度梯度为0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L。取 96 孔板，加 200 µL ABTS 工作液，空白对照孔中加10µL蒸馏水；各检测孔中加入10µL待测样品或Trolox 标准溶液。将加样后的孔板混和均匀，室温孵育2～6 min，用酶标仪测定734 nm 处的吸光值。依照标准曲线计算样品的总抗氧化能力，总抗氧化能力的表示方法用水溶性维生素E等效抗氧化能力表示。

2.4 DPPH自由基清除能力的测定

待测样品设置三个检测浓度（0.1、0.01、0.001 mg/mL），阳性对照和空白对照分别设置为维生素C和无水乙醇。量取200µL 样品液和对照溶液，加入等体积的0.1 mmol/L DPPH 溶液，混和均匀，室温避光反应30 min，测定517 nm 处吸光值，最后计算DPPH自由基清除率。

式中：OD0为不加样品的空白组；OD1为扣除干扰色后的样品组。

2.5 一氧化氮（NO）清除作用测定

将不同浓度（1.0、0.1、0.01、0.001 mg/mL）的样品（2 µL）与98 µL 亚硝酸钠（0.1 mM），以蒸馏水为空白对照，以维生素C为阳性对照，各组样品分别在25℃下混合反应30 min。然后添加100µL Griess 试剂（0.1%萘二胺二盐酸盐、5%磷酸和1%磺胺）检测560 nm处的吸光值，并计算清除率。

式中：OD0为不加样品的空白组；OD1为扣除干扰色后的样品组。

2.6 对乙酰氨基酚诱导HepG2 细胞株炎症损伤测定

接种对数期细胞100 µL（5×103个细胞）于96 孔板，培养 24 h 后，加入样品（终浓度为0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2 mg/mL），补充培养液至每孔总体积为 200 µL，继续培养 24 h 后，加入 12 mmol/L APAP 继续培养6 h。设置空白对照和空白调零组。培养结束后，在倒置显微镜下观察各组检测孔中细胞形态。之后于每孔加入10 µL 0.5 mg/mL MTT 培养5 h，除去培养液，加入200µL DMSO充分溶解，检测490 nm处各孔的吸光值，计算细胞相对存活率。

式中：A0为未添加样品的对照组；A1为添加样品的实验组。

3 结果

3.1 SEE的总酚含量

在植物体中，酚类物质有很多，含量多且最具代表性的是没食子酸。以没食子酸为主的酚类物质在碱性溶液中将钨钼酸还原成蓝色化合物，该化合物在760 nm 处有最高吸收峰。经没食子酸标准曲线方程Y = 31.31X + 0.05945（R2=0.9942）计算得出SEE总酚含量为53.21µg GAE/mg。

3.2 SEE的总抗氧化能力

水溶性维生素E 是维生素E 类似物，具有和维生素E 相近的抗氧化能力。通常以水溶性维生素E为标准物质，测定其他抗氧化物质相对抗氧化能力。本次测得标准方程：Y = 3.672X—0.01776（R2=0.9923），通过标准方程计算SEE总抗氧化能力。结果表明，SEE的总抗氧化活性为（5.359±0.02）mmol/g。

3.3 SEE对DPPH 自由基的清除能力

采用DPPH 自由基清除试验评价耳柄蒲儿根萃取物的清除自由基的能力。试验结果表明，耳柄蒲儿根萃取物具有较好的清除自由基活性，半数抑制率浓度为（0.52± 0.02）mg/mL，略大于维生素C 的半数抑制率浓度（0.49±0.03）mg/mL。

3.4 SEE对一氧化氮（NO）的清除能力

采用NO 清除试验评价SEE 体外清除NO 自由基的能力。试验结果表明，耳柄蒲儿根萃取物体外清除NO的作用为1 mg/mL的SEE对NO自由基的相对清除率为6.68%。

3.5 SEE 对APAP 诱导的HepG2 人肝癌细胞株损伤作用测定

APAP 可造成肝癌细胞损伤，并随着浓度升高而损伤加重，最终导致肝癌细胞存活率降低。经前期试验摸索，12 mmol/L APAP 处理条件下，HepG2人肝癌细胞存活率在62.6%。经不同浓度SEE 处理后，HepG2 人肝癌细胞株存活率轻微升高，其中0.08 mg/mLSEE 处理组细胞存活率为77.0%。如下图1（a，b）所示。

图1 （a，b）耳柄蒲儿根萃取物（SEE）对APAP诱导HepG2细胞株氧化损伤的作用Fig.1 （a，b）The effect of SEE on 4-acetamidophenol-induced oxidative damage of HepG2 cell lines

4 讨论与结论

经大孔树脂AB8 纯化后获得耳柄蒲儿根萃取物SEE，相较于其他植物来源，如玫瑰果及伦晚脐橙等［5-6］，总酚含量明显较低。过去研究发现，从蒲儿根花中鉴定出β-谷甾醇、金丝桃苷及咖啡酸［7-9］等酚类物质也都具有良好的抗氧化作用。从本试验结果可以得出，耳柄蒲儿根萃取物SEE 对于DPPH及ABTS 自由基具有较强的清除能力，但对于抗炎指标NO的清除率却明显较低。

耳柄蒲儿根萃取物SEE在0.08 mg/mL时具有较好的提高细胞抵抗氧化损伤能力，且研究发现从蒲儿根花中的金丝桃苷及咖啡酸对于大鼠肝细胞损伤也具有一定的保护作用［10-11］，推测耳柄蒲儿根萃取物的修复细胞氧化损伤作用源自此类化合物的功效。

本研究中的耳柄蒲儿根萃取物虽然多酚类物质含量低，却有明显修复细胞株氧化损伤的作用，显示该研究为其之后开发成天然抗氧化物质奠定了生化和细胞学水平上的理论基础。