外周血单核细胞PD- L2 分子在系统性红斑狼疮中的应用

柳毓文 刘 萍 胡 娜 葛洪亮 彭雨薇

江西省萍乡市人民医院风湿免疫科，江西萍乡 337000

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）属于自身免疫性疾病，患者多伴有发热、关节疼痛、蝶形红斑等症状，若未得到及时治疗，可能会累及多个系统，引起多种并发症[1-2]。SLE 疾病活动指数（SLE disease activity index，SLEDAI）为临床评估 SLE 患者病情严重程度的常用方法， 可将SLE 分为活动期与缓解期，但SLEDAI 容易受评估人主观意识影响，且评估内容较多， 导致其在临床中应用存在一定局限性。而临床对于不同病情的SLE 患者其治疗方法也不尽相同，缓解期患者经临床积极治疗后预后良好，病情容易控制，但活动期患者临床治疗难度较高，且病情复杂，极易引发狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN），严重损伤肾脏功能，影响疾病预后[3-4]。因此，采取有效的手段积极评估SLE 患者病情具有重要意义。 程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）、程序性死亡配体-2（programmed death ligand-2，PD-L2）均为程序性死亡受体1（programmed death receptor 1，PD-1）的配体，研究指出，PD-1 与其配体组成的信号途径具有负调节免疫反应作用，且在免疫活化与耐受中具有重要作用[5]。 以往，临床对PD-1 的配体PD-L1关注度较高，而有关PD-1 的另一个配体PD-L2 关注度较低。 基于此，本研究旨在分析外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的 PD-L2 分子在SLE 中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析 2019 年 1 月至 2020 年 1 月萍乡市人民医院收治的 30 例 SLE 患者临床资料，将SLEDAI[6]评分＞5 分的15 例活动期狼疮性肾炎患者纳入活动期组，将SLEDAI 评分≤5 分的15 例缓解期狼疮患者纳入缓解期组，并选取同期于萍乡市人民医院接受治疗的10 例类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者作为活动期阳性对照病例纳入RA 组及接受体检的10 例健康志愿者纳入正常对照组。 活动期组中，男 3 例，女 12 例；年龄 46~74 岁，平均（58.69±2.36）岁；病程 2~6 个月，平均（4.04±0.52）个月；体重指数（body mass index，BMI） 21~27 kg/m2，平均（22.89±1.25）kg/m2。 缓解期组中，男 5 例，女 10 例；年龄 46~75 岁，平均（58.73±2.08）岁；病程 2~6 个月，平均（4.02±0.55） 个月；BMI I21~27 kg/m2， 平均 （22.92±1.19）kg/m2。RA 组中，男 4 例，女 6 例；年龄 44~72 岁，平均（58.91±2.15）岁；病程 1~5 个月，平均（4.03±0.32）个月；BMI 22~27 kg/m2，平均（23.10±1.06）kg/m2。 正常对照组中，男 6 例，女 4 例；年龄 45~73 岁，平均（59.02±2.10）岁；BMI 21~27kg/m2，平均（22.96±1.20）kg/m2。 纳入标准：①患者符合《系统性红斑狼疮诊断及治疗指南》[7]内相关诊断标准，LN：尿蛋白定量＞0.5 g/d；②年龄18~75 岁者；③活动期组患者未用过激素和免疫抑制剂或停药后复发。 排除标准：①妊娠期或哺乳期妇女；②伴有其他系统性结缔组织病者；③合并肿瘤性疾病者。 四组患者性别、年龄、BMI 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。 本研究经萍乡市人民医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

PBMC 的PD-L2 分子表达水平检测：①实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，Real-time PCR） 检测 PDL2 分子表达水平方法如下： 应用淋巴细胞分层液（Ficoll）梯度分离 PBMC，使用 TRIzol 抽提 PBMC 中总 RNA（TaKaRa，大连），Oligo-dT 反转录为 cDNA 后置于-20oC 下备用。 内参引物为 β-actin，序列为：正向 5′-ATCTGCCACCACACCTTCTACC-3′； 反向 5′-GATAGCACAGCCTGGATAGCAA3′。 PD-L2 引物序列为：正向 5′-GTCAGATGGAACCCAGGACC-3′；反向5′-TAGGCTCCAGAGGTGAGTCC-3′。 Real-time PCR使用德国QIGEN 公司提供的SYBR，采用PCR 两步法进行试验，具体为 60℃、30 s，90℃、10 s，45 个循环，结果应用循环阈值（cycle threshold，CT）表示，基因表达量为目的基因PD-L2 的CT 值-内参引物CT 值得到的△CT。 ②流式细胞术检测PD-L2 分子表达水平方法如下： 使用流式细胞术评估外周血T 细胞、B 细胞与PBMC 中 PD-L2 的表达。 使用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline solution，PBS） 对方法①中得到的PBMC 进行洗涤， 并制成1×106单细胞悬液，提取50 μl 单细胞混悬液与3 μl 德国美天旎公司提供的异硫氰酸荧光素标记CD14 抗体及美国BD 公司提供的抗原呈递细胞标记PD-L2 抗体共孕0.5 h，经PBS 洗涤后避光保存待检，使用美国BD 公司提供的Accuri C6 型流式细胞仪进行检测。

1.3 观察指标及评价标准

记录患者PD-L2 分子表达水平、比较各组PD-L2分子表达水平、分析SLEDAI 评分与PD-L2 分子表达水平的相关性、 及PD-L2 分子对SLE 患者病情活动程度的预测价值。 ①记录不同性别、年龄、体重患者PD-L2 分子表达水平。 ②比较四组患者PD-L2 分子表达水平。 ③分析SLE 患者SLEDAI 评分与PD-L2分子表达水平的相关性。 ④分析PD-L2 分子表达水平对SLE 患者病情活动程度的预测价值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析， 计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t 检验；计数资料用率表示， 组间比较采用 χ2检验；SLEDAI 评分与PD-L2 分子表达水平的相关性分析采用Pearson 相关性检验；绘制受试者工作曲线（receiver operating curve，ROC），得到曲线下面积（area under the curve，AUC），分析PD-L2 分子表达水平对SLE 患者病情严重程度的预测价值，以P＜0.05 为差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 不同性别、年龄、体重SLE 患者PD-L2 分子表达水平的比较

不同性别、年龄、体重的SLE 患者PD-L2 分子表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表 1）。

表1 不同性别、年龄、体重SLE 患者PD-L2 分子表达水平的比较（）

表1 不同性别、年龄、体重SLE 患者PD-L2 分子表达水平的比较（）

组别 例数 PD-L2 t 值 P 值性别（例）0.6880.497男女8 22 10.26±2.13 10.85±2.06年龄（岁）＜60≥60体重（kg/m2）＜24≥24 0.9280.361 23 7 11.03±1.89 11.74±1.25 0.1190.906 21 9 10.11±1.76 10.03±1.49

2.2 四组患者PD-L2 分子表达水平的比较

活动期组PD-L2 分子表达水平高于缓解期组与正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；活动期组PD-L2 分子表达水平与RA 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表 2）。

表2 四组患者PD-L2 分子表达水平的比较（%，）

表2 四组患者PD-L2 分子表达水平的比较（%，）

与活动期比较，aP＜0.05

组别 例数 PD-L2活动期组缓解期组RA 组正常对照组F 值P 值15 15 10 10 14.02±3.12 9.79±1.02a 17.02±4.36 6.16±1.05a 33.502＜0.001

2.3 SLE 患者SLEDAI 评分与PD-L2 分子表达水平的相关性分析

活动期组患者 SLEDAI 评分为（8.45±2.13）分，缓解期组患者 SLEDAI 评分为（3.01±0.54）分。 经 Pearson 相关性分析发现，SLE 患者SLEDAI 评分与 PDL2 分子表达水平呈正相关（r=0.946，P=0.000）。

2.4 PD-L2 分子表达水平对SLE 患者病情活动程度的预测价值

将SLE 患者病情活动程度作为状态变量（1=活动期，0=缓解期）， 将PD-L2 分子表达水平作为检验变量，绘制 ROC 曲线（图 1），结果显示，PD-L2 分子表达水平预测SLE 患者处于活动期的 AUC 为0.820，AUC 的 95%置信区间为 0.662~0.978， 标准误为0.081，P 值为 0.003，最佳阈值为12.17%，灵敏度为0.800，特异度为0.800，约登指数为0.600，具有较高的预测价值。

图1 PD-L2 分子表达水平对SLE 患者病情活动程度的预测价值的ROC 曲线图

3 讨论

SLE 发生后可能会累及肾脏、血液、呼吸道、淋巴等脏器与系统，以肾脏损伤最为常见，且该疾病发生与发展均与免疫功能紊乱有关，并且免疫功能情况与疾病活动情况及器官损伤具有密切联系[8]。 而PBMC的PD-L2 分子表达与免疫功能有关[9]。

已有大量研究显示，SLE 患者 PBMC 中 PD-1、PD-L1 表达异常，且提出PD-1 受体表达降低会严重影响机体免疫耐受功能， 进而生成大量自身抗体，而关于PD-1 另一个配体PD-L2 在SLE 患者中的生物学功能机制尚未明确[10-12]。本研究结果显示，活动期组PD-L2 分子表达水平高于缓解期组与正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；活动期组 PD-L2 分子表达水平与 RA 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 经Pearson 相关性分析发现，SLE 患者 SLEDAI 评分与PD-L2 分子表达水平呈正相关（r=0.946，P=0.000），提示PBMC 的PD-L2 分子表达水平可能与SLE 患者病情活动程度存在一定关联，且表现为正相关。 分析其原因为，PD-1/PD-L 为CD28/B7 家族重要成员，可通过抑制T 细胞活化与增殖发挥调控免疫应答作用，而近年来，也有研究指出其对T 细胞活化也具有一定作用[13-14]。已有研究发现，一系列正性与负性刺激信号共同介导了T 细胞活化， 而PD-L2 分子是一种重要的负性共刺激分子，故其对T 细胞活化也可能具有一定作用[15-16]。 根据上述研究结果，本研究推测，PD-L2 分子高表达可能是SLE 患者病情严重程度的预测因子。为证实这一推测，最后绘制ROC 曲线，结果显示，PD-L2 分子表达水平预测SLE 患者处于活动期的AUC 为0.820，具有较高的预测价值，表明PD-L2 可作为SLE 患者病情严重程度的预测因子。 鉴于本研究样本量较少，若条件允许，后期工作可进一步扩大样本来以证实本研究结果，此工作可能为探索PD-L2分子生物学功能， 为研究SLE 发病机制及预后评估中提供参考依据。

综上所述，PBMC 的PD-L2 分子表达水平与SLE患者病情活动程度密切相关，临床可通过检测PBMC的PD-L2 分子表达水平及时评估SLE 患者病情状况，以制定有效的治疗方案。