基于网络药理学探讨益气活血方抗肝纤维化作用的活性成分及其分子机制研究

杨 提，曾婷婷，张卉青，叶琳岚，蔺婷婷，丁 楠*

(1.海军军医大学长海医院药学部，上海 200433；2.上海市浦东新区公利医院药剂科，上海 200135；3.联勤保障部队天津康复疗养中心药械科，天津201112；4.广东省东莞市滨海湾中心医院药剂科，广东东莞 523900)

肝纤维化(liver fibrosis)是多种慢性肝病共有的病理特征，主要表现为肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度增生和异常沉积[1]。肝纤维化的本质是肝脏对于各种慢性损伤的一种修复反应。多种因素造成的肝损伤如慢性病毒感染(主要是丙型和乙型肝炎)、过量饮酒、代谢紊乱或自身免疫损伤等均可引起肝内结缔组织的异常增生，引发肝纤维化。长期且持续的肝纤维化会造成器官结构破坏，功能衰退，最终可能导致肝硬化、终末期肝病或肝癌。由于肝纤维化的发病机制复杂，目前临床上尚未发现理想的抗肝纤维化药物，因此，寻找更为有效和安全的药物是防治肝纤维化的关键问题。

研究表明，传统中药复方因具有多靶点、多途径且毒性低等优点，在抗肝纤维化的治疗中发挥着重要作用。其中益气活血方可通过抑制HSCs活化和促进胶原降解减轻ECM的过度积聚，进而延缓肝纤维化的进程[2]。益气活血方因成分复杂，其抗肝纤维化的活性成分以及分子机制至今并不十分明确，尚待深入研究。网络药理学是基于网络生物学和多向药理学，通过构建疾病、基因、靶标和药物等之间的相互作用网络，从整体角度出发，较为全面地解释中药组分靶点以及途径间的相互作用关系的学科[3]。本研究通过网络药理学方法，建立益气活血方主要成分-靶点网络图，预测其发挥抗肝纤维化作用的主要活性成分、作用靶点及通路，为中医药防治肝纤维化的机制研究提供理论基础与科学依据。

1 资料和方法

1.1 分析软件和数据库 Cytoscape 3.7.2软件、R语言软件(https://www.r-project.org/)；中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，网址http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、中医药综合数据库(Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID，网址http://www.megabionet.org/tcmid/)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)，String数据库(http://string-db.org/cgi/input.pl)。

1.2 益气活血方有效化合物的筛选 益气活血方由黄芪、丹参、云茯苓、白豆蔻、郁金、内金6味中药组成。通过TCMSP和TCMID分别检索6味中药的主要化学成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥ 30%和类药性(drug-likeness，DL)≥ 0.18为依据筛选潜在的药效成分，并获取各活性成分的蛋白质靶点。筛选结束后，为标准化蛋白质靶点信息，在UniProt蛋白质数据库将各活性成分的蛋白质靶点名称进行规范。

1.3 构建益气活血方“活性成分-靶点”网络 主要通过Cytoscape 3.7.2软件构建与分析益气活血方“活性成分-靶点”网络，其中用“节点”(node)表示成分或靶点，用“边”(edge)表示两者之间的关系；采用Cytoscape 3.7.2软件内置的network analyzer分析工具分析网络特征参数，包括连接度、介度及紧密度等，研究益气活血方中较为重要的活性成分和靶点及两者之间的关系。

1.4 肝纤维化靶点筛选 利用GeneCards数据库分别检索“hepatic fibrosis”、“liver fibrosis”获取肝纤维化相关靶点，以相关性分值(relevance score)≥14为筛选条件，获得相关性较大的基因作为疾病候选靶点。

1.5 网络构建 为探究益气活血方药物与肝纤维化之间的相互作用关系，利用Venny 2.1.1软件分析两者的作用靶点，最终获得益气活血方防治肝纤维化的潜在作用靶点，并以韦恩(Venn)图的形式展现。通过潜在靶点获得相应的潜在化合物及其所属中药名称，并利用Cytoscape 3.7.2软件建立中药-潜在化合物-潜在靶点-疾病网络图。

1.6 基因本体功能与通路富集分析 基因本体(gene ontology,GO)是对基因和蛋白质功能进行限定和描述的数据库，包括细胞组分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)、生物过程(biological process，BP)三个部分，因不同基因在生物体内协同发挥相应的生物学功能，基于京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集通路的分析，更有助于了解基因的生物学功能。应用R语言软件中clusterProfiler GO.R插件及Perl语言对益气活血方活性成分与肝纤维化的共同靶点进行GO分析以及KEGG通路富集分析，并对分析结果进行可视化，探究益气活血方防治肝纤维化可能涉及的生物功能和信号通路。

1.7 观察指标 观察指标为益气活血方主要活性成分，以及活性成分与肝纤维化的共同蛋白质靶点之间的联系。

2 结 果

2.1 益气活血方活性成分及靶点获取结果 通过TCMSP和TCMID检索益气活血方中的6味中药，并以OB≥30%和DL≥0.18为条件筛选活性成分，经过Uniprot数据库检索并剔除重复值，得到82种候选活性成分及323个靶点。

2.2 肝纤维化候选靶点筛选结果 通过GeneCards数据库分别检索关键词“hepatic fibrosis”、“liver fibrosis”，根据relevance score≥14筛选相关性较大的靶点，合并2个关键词搜索结果后，删除重复值，共得到肝纤维化相关靶点881个，作为肝纤维化候选靶点。

2.3 潜在活性化合物及靶点筛选结果 采用Venny 2.1.1软件将益气活血方候选靶点与肝纤维化候选靶点取交集，得到109个共有靶点(见图1)，以及对应的潜在72种活性化合物，并根据潜在靶点与化合物可知所属中药名称，见表1。

表1 益气活血方治疗肝纤维化的相关信息Table 1 Information related to the treatment of liver fibrosis with Yiqi Huoxue decoction

2.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络 将筛选出的109个共有靶点输入String数据库，限定物种为人，其他参数设定为默认值，剔除孤立的靶点蛋白，得到益气活血方靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction network，PPI)，见图2。

图2 益气活血方抗肝纤维化药物活性成分-疾病共有靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络Figure 2 Protein-protein interaction network of common targets between active components of Yiqi Huoxue decoction and liver fibrosis

(续表)

应用R语言count.R插件统计出现频次在前20位的蛋白质靶点，其中出现频次较高的有转录激活因子-3(signal transducer and activator of transcription-3，STAT3)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-1(serine/threonine protein kinase-1，AKT1)、原癌基因(proto-oncogene，JUN)、抑癌基因TP53等，可作为益气活血方抗肝纤维化的潜在靶点。

2.5 网络构建结果 利用Cytoscape 3.7.2软件构建中药-潜在化合物-共有靶点-疾病网络，得到184 个节点(110个靶点，72个活性成分，疾病和药物各1个)，708条边，见图3。

图3 益气活血方抗肝纤维化药物活性成分-疾病靶点网络图aFigure 3 Network diagram of active components of Yiqi Huoxue decoction and liver fibrosis targetsaa：粉红色代表益气活血方，黄色代表肝纤维化，蓝色代表益气活血方活性成分，绿色代表益气活血方抗肝纤维化药物活性成分-疾病共有靶点

网络拓扑学分析结果显示，槲皮素(quercetin)连接度为80，介度为0.193 1，紧密度为0.570 1，预测槲皮素为益气活血方防治糖尿病心肌病的主要成分，其次为木犀草素(luteolin，连接度为39，介度为0.049 8，紧密度为0.458 6)、山奈酚(kaempferol，连接度为35，介度为0.038 9，紧密度为0.447 4)，柚皮素(naringenin，连接度为22，介度为0.026 7，紧密度为0.422 6)，见表2。

表2 益气活血方主要活性成分网络节点特征参数Table 2 Network node characteristic parameters of main active components of Yiqi Huoxue decoction

2.6 GO功能分析及KEGG富集通路结果 利用R语言对潜在作用靶点进行基因富集分析(根据Ben-jamin校正法、P<0.05)，进一步探讨益气活血方抗肝纤维化的作用机制。将GO富集分析结果分为BP、CC、MF三类，并根据信号通路中基因所占总体输入基因的比率(GeneRatio)排列(展示前15位，见图4)。气泡颜色由红到紫代表P值从小到大，P值越小代表显著性越强，气泡越大代表该通路的基因计数越大，横轴代表该信号通路基因所占总体输入基因的比率。图4A表明益气活血方抗肝纤维化靶点富集主要涉及的生物学过程为营养元素的应答过程(response to nutrient levels)、脂多糖的应答过程(response to lipopolysaccharide)、氧化应激反应(response to oxidative stress)、类固醇代谢应答过程(response to steroid hormone)、脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)、活性氧代谢过程(reactive oxygen species metabolic process)、小分子代谢过程的调控(regulation of small molecule metabolic process)等。图4B为细胞组分分析，可见关键靶点主要作用于囊泡腔(vesicle lumen)、膜筏(membrane raft)、膜微结构域(membrane microdomain)等。图4C为分子功能分析结果，可见相关靶点抗肝纤维化的功能主要富集于受体配体活性(receptor ligand activity)、信号受体激活剂活性(signaling receptor activator activity)、细胞因子受

体结合(cytokine receptor binding)、细胞因子活性(cytokine activity)、 DNA结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)等。KEGG通路富集分析结果根据GeneRatio排序，展示排名前20位的信号通路，如图4D所示，益气活血方抗肝纤维化的作用靶点主要包括PI3K-Akt信号通路、流体剪应力与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、MAPK信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路等，体现了益气活血方多成分、多靶点、多通路的作用特点。

3 讨 论

肝纤维化是肝脏对损伤的修复反应，是各种慢性肝病共有的病理改变，以ECM在肝脏过度沉积为特征， 属可逆病变。根据中医经典理论并结合临床经验，肝纤维化的主要病机为“气虚血瘀、肝郁脾虚”，采用“益气活血、健脾化瘀”方法可改善肝脏储备功能，延缓或阻止肝纤维化进程。益气活血方经过多名中医药专家论证，具有滋肝补肾、疏肝健脾之功效，方中黄芪扶正补气，丹参、郁金活血祛瘀、利胆退黄，云茯苓健脾宁心，白豆蔻开胃消食，临床上多用于慢性病毒性肝炎肝纤维化的治疗。

本研究通过网络药理学方法初步筛选出益气活血方抗肝纤维化的活性成分为槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素、丹参酮Ⅱa等。槲皮素、木犀草素、柚皮素均属天然的黄酮类化合物，具有抗肝纤维化的药理特性。WU等[4]发现槲皮素可通过抑制TGF-β1/Smads信号通路并激活PI3K/Akt信号通路，来抑制经胆管结扎或四氯化碳诱导的肝硬化模型小鼠的肝脏细胞自噬反应，从而减轻肝脏损伤。WANG等[5]发现槲皮素还能以剂量依赖的方式调节NF-κB/IкBα、p38 MAPK和Bcl-2/Bax信号的传导，延缓肝纤维化的进程。CUMMINS等[6]利用人和鼠的肝星状细胞系研究发现，木犀草素可通过下调STAT3总量及其磷酸化水平，并抑制其转录活性，进而抑制HSCs活化，发挥抗肝纤维化的作用。LIU等[7]发现在TGF-β1诱导的HSC-T6细胞中，柚皮素可通过选择性抑制Smad3的转录，从而抑制HSCs增殖和ECM的积聚，减轻肝纤维化程度。山奈酚是一种天然黄酮醇，具有显著的抗氧化应激活性，可以抑制多种抗氧化酶的表达并减弱脂质过氧化反应，从而发挥肝细胞保护作用[8]。丹参酮为活血化瘀药。丹参酮Ⅱa是丹参酮的主要活性成分之一，通过改造其结构，形成磺酸钠盐，提高其水溶性，在清除肝脏炎症、阻滞钙离子通道，改善肝脏微循环，逆转或者抑制肝纤维化方面发挥着重要作用[9]。以上提示益气活血方活性成分的筛选具有一定的依据。

本研究对益气活血方与肝纤维化的共同靶点进行PPI映射并构建药物活性成分-肝纤维化-共有靶点网络图，对网络进行拓扑学分析后发现，出现频次较高的关键靶点有STAT3、TNF-α、AKT1、JUN、TP53等，可作为益气活血方抗肝纤维化的潜在靶点。STAT3是STAT蛋白家族的成员，作为一种转录因子，在肝纤维化进程中占有重要地位[10]。TNF-α为一种致炎因子，可诱导多种纤维化相关因子形成信号网络，共同调控肝纤维化过程[11]。AKT1作为AKT家族成员之一，参与细胞代谢、调亡、转录调控多种生理过程。JUN与抑癌基因TP53在肝纤维化中的关系尚未见报道，今后可加强这方面的研究。以上研究结果提示，益气活血方可能通过上述几个关键靶点之间的协同作用共同发挥抗肝纤维化作用。

GO分析和KEGG通路富集分析明确了益气活血方在抗肝纤维化作用中的生物学过程以及信号通路。其中涉及的主要生物学过程包括营养元素的应答过程、脂多糖的应答过程、氧化应激反应、类固醇代谢应答过程、脂多糖的反应、活性氧代谢过程、小分子代谢过程的调控等，表明益气活血方可能通过调控多个复杂的生物学过程发挥抗肝纤维化作用；涉及的主要信号通路包括PI3K-Akt信号通路、流体剪应力与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、MAPK信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路等，这些通路与肝炎、肝癌等肝脏相关疾病有密切的关系，在肝纤维化过程中有着重要作用，也表明益气活血方通过作用于多个信号通路共同发挥抗肝纤维化作用。

综上所述，本研究通过网络药理学技术分析了益气活血方抗肝纤维化的分子机制，该过程涉及多个不同的生物学过程和信号通路，体现了中医药多成分、多靶点联合作用，全方位治疗疾病的整体思路。但是本研究仅是以生物信息学和网络数据库为基础对益气活血方抗肝纤维化分子机制的预测，后续还需要进一步对分析所得的核心成分、关键靶点以及信号通路进行实验验证，进而阐明益气活血方发挥抗肝纤维化作用具体的分子机制。