胃癌组织lncRNA MAFG-AS1、miR-143-3p表达变化及其临床意义

赵艳争，佘坤，郭青，季艳霞，王忠瑜，孙彩云

1 邯郸市中心医院肿瘤四科，河北邯郸056000；2 河北工程大学附属医院神经外科

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，由于其早期多无症状或仅表现为上腹不适、反酸、喛气等非特异性症状，很容易被患者忽视，超过80%患者出现典型症状或体征就诊时已进展至中晚期，预后较差[1]。但目前临床上尚未发现一种灵敏度高、特异性强的早期胃癌生物标志物。非编码RNA是指转录组中不翻译为蛋白质的RNA分子，虽然不编码蛋白质，但在调节蛋白编码基因的转录、翻译及稳定性等方面却具有重要作用。长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，微小RNA(miRNA)是一类长度21～25 nt的内源性单链小分子RNA，二者不仅在基因表达调控中具有重要作用，在细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程中亦能发挥重要作用。近年研究发现，部分lncRNA、miRNA异常表达可能与胃癌的发生、发展有关[2]。碱性亮氨酸拉链家族转录因子V-Maf鸟类肌筋膜纤维肉瘤癌基因同源物G(MAFG)-反义核糖核酸1(AS1)是近年新发现的一种lncRNA。有研究报道，lncRNA MAFG-AS1在肝癌、乳腺癌组织中表达上调，并能促进肿瘤细胞增殖和侵袭[3-4]。miR-143-3p是miRNA家族成员之一。有研究报道，miR-143-3p在肺癌组织中表达上调，并能促进肿瘤细胞侵袭和迁移[5]；但miR-143-3p在卵巢癌组织中表达下调，并抑制肿瘤细胞增殖和迁移[6]。赵晨阳等[7]研究发现，lncRNA MAFG-AS1 3′非翻译区存在miR-143-3p的结合位点，lncRNA MAFG-AS1可能通过靶向miR-143-3p调控宫颈癌细胞增殖。但目前lncRNA MAFG-AS1、miR-143-3p表达与胃癌的关系鲜见报道。本研究观察了胃癌组织lncRNA MAFG-AS1、miR-143-3p表达变化，并探讨其表达变化与患者临床病理特征和预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年1月—2018年3月邯郸市中心医院收治的胃癌患者105例。所有患者经术后病理检查明确诊断。纳入标准：①符合胃癌诊断标准；②初诊，入组前未接受任何抗肿瘤治疗；③年龄>18岁；④接受根治性或姑息性手术；⑤临床病理资料和术后随访资料完整。排除标准：①合并其他胃部疾病者；②合并其他部位肿瘤者；③合并重要脏器严重疾病者。其中，男56例、女49例，年龄(65.07±7.85)岁(≥60岁62例、<60岁43例)；肿瘤直径：≥3.5 cm 57例，<3.5 cm 48例；肿瘤部位：贲门或胃底37例，胃体19例，胃窦49例；组织分化程度：高中分化63例，低分化42例；浸润深度：黏膜层或黏膜下层31例，肌层或浆膜层74例；pTNM分期：Ⅰ、Ⅱ期73例，Ⅲ期32例；有淋巴结转移30例、无淋巴结转移75例。本研究经邯郸市中心医院医学伦理委员会批准(审批编号：ZXYY2021004)，所有患者或其家属知情同意并签署书面知情同意书。

1.2 lncRNA MAFG-AS1、miR-143-3p表达检测 取手术切除的新鲜胃癌组织及其配对的癌旁组织(距肿瘤组织边缘5 cm以上，并经病理检查证实为正常胃组织)，采用TRIzol法提取组织总RNA，按PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit说明合成第一链cDNA。反应条件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。以cDNA为模板，按SYBR Green qPCR Mix说明进行PCR扩增。所有引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成。引物序列：lncRNA MAFG-AS1上游引物5′-ATGACGACCCCCAATAAAGGA-3′，下游引物5′-CACCGACATGGTTACCAGC-3′，扩增片段大小103 bp；miR-143-3p上游引物5′-CGAGAGTGAGATGCACTG-3′，下游引物5′-ATCCAGTGCAGGCGAGG-3′，扩增片段大小112 bp；内参U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，扩增片段大小105 bp。PCR反应体系共50 μL：cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，Premix Ex Taq DNA 聚合酶25 μL，RNase-Free ddH2O 21 μL；反应条件：95 ℃预变性3 min，98 ℃变性2 s、67 ℃退火15 s、72 ℃延伸20 s共30个循环。所有操作于CFX96实时荧光定量PCR仪上完成。PCR扩增反应结束，绘制熔解曲线，收集循环阈值(CT)数。以U6为内参，采用2-ΔΔCT法计算lncRNA MAFG-AS1、miR-143-3p相对表达量。

1.3 随访 所有患者出院后电话随访3年，每3个月一次。以患者出现全因死亡或随访3年结束时终止随访，统计随访期间患者生存情况。

2 结果

2.1 胃癌组织与癌旁正常组织lncRNA MAFG-AS1、miR-143-3p表达比较 胃癌组织与癌旁正常组织lncRNA MAFG-AS1相对表达量分别为3.02±1.11、1.05±0.27，miR-143-3p相对表达量分别为1.63±0.34、3.79±1.25。胃癌组织lncRNA MAFG-AS1相对表达量高于癌旁正常组织，miR-143-3p相对表达量低于癌旁正常组织(t分别为17.671、17.086，P均<0.05)。

2.2 胃癌组织lncRNA MAFG-AS1、miR-143-3p表达与患者临床病理特征的关系 见表1。

表1 胃癌组织lncRNA MAFG-AS1、miR-143-3p表达与患者临床病理特征的关系

2.3 胃癌组织lncRNA MAFG-AS1表达与miR-143-3p表达的关系 胃癌组织lncRNA MAFG-AS1表达与miR-143-3p表达呈负相关关系(r=-0.699，P<0.05)。见图1。

图1 胃癌组织lncRNA MAFG-AS1表达与miR-143-3p表达关系的散点图

2.4 胃癌组织lncRNA MAFG-AS1、miR-143-3p表达与患者预后的关系 105例胃癌患者中，随访期间死亡34例。以lncRNA MAFG-AS1、miR-143-3p相对表达量的均数为临界值，将患者分为lncRNA MAFG-AS1高表达者55例与lncRNA MAFG-AS1低表达者50例、miR-143-3p高表达者48例与miR-143-3p低表达者57例。lncRNA MAFG-AS1高表达者与lncRNA MAFG-AS1低表达者3年总生存率分别为58.18%(32/55)、78.00%(39/50)，lncRNA MAFG-AS1高表达者3年总生存率低于lncRNA MAFG-AS1低表达者(χ2=4.783，P<0.05)；miR-143-3p高表达者与miR-143-3p低表达者3年总生存率分别为79.17%(38/48)、57.89%(33/57)，miR-143-3p高表达者3年总生存率高于miR-143-3p低表达者(χ2=5.383，P<0.05)。见图2、3。

图2 胃癌组织不同lncRNA MAFG-AS1表达者的生存曲线

图3 胃癌组织不同miR-143-3p表达者的生存曲线

3 讨论

胃癌是一种发病率和病死率均较高的恶性肿瘤，其发病机制尚不完全清楚，通常认为是遗传因素和环境因素共同作用的结果。早期胃癌的治疗效果较好，患者5年总生存率多在95%以上。但胃癌早期多无症状或仅表现为上腹不适、反酸、喛气等非特异性症状，很容易被患者忽视，大部分胃癌患者就诊时已进展至中晚期，预后较差[8]。目前临床上尚未发现一种灵敏度高、特异性强的早期胃癌诊断生物标志物。因此，深入探索胃癌发病的分子机制，寻找一种能够早期筛查的肿瘤生物标志物，对胃癌早期诊断具有重要意义。

lncRNA是一类具有高度组织特异性的非编码RNA，能够在表观遗传、转录和转录后等层面上调控基因的表达[9]。lncRNA作为miRNA的前体，可通过诱导染色质修饰、调控信使RNA或作为竞争性内源RNA与靶基因竞争性结合miRNA，从而调控miRNA表达，继而通过引起DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑等诱发肿瘤发生[10]。lncRNA MAFG-AS1是近年新发现的一种具有致癌作用的lncRNA，与MAFG共享一个头对头启动子并拥有CpG岛，可通过诱导DNA甲基化促进肿瘤的发生、发展。lncRNA MAFG-AS1可作为miRNA海绵靶向调控其基因表达，从而参与恶性肿瘤的生物学行为[11]。有研究报道，lncRNA MAFG-AS1在膀胱癌组织中表达上调，并且其高表达与膀胱癌组织学分级、肿瘤直径、淋巴结转移密切相关；lncRNA MAFG-AS1可能通过靶向miR-125b-5p调节下游靶标鞘氨醇激酶1表达，从而促进膀胱癌细胞增殖、侵袭和迁移[12]。lncRNA MAFG-AS1在肝癌组织中表达增加，lncRNA MAFG-AS1可通过负性调控miR-6852促进肝癌细胞增殖、侵袭和迁移[3]。lncRNA MAFG-AS1在乳腺癌、非小细胞肺癌组织中表达升高，lncRNA MAFG-AS1通过靶向抑制miR-339-5p促进基质金属蛋白酶15表达，增强肿瘤细胞的侵袭、迁移以及上皮间质转化[4，13]。有研究报道，lncRNA MAFG-AS1过表达能够促进胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移[14]。本研究结果发现，胃癌组织lncRNA MAFG-AS1表达上调，并且其表达与胃癌组织分化程度、浸润深度、pTNM分期、淋巴结转移以及患者预后有关。提示lncRNA MAFG-AS1在胃癌中可能发挥促癌基因作用，但其具体机制仍不十分清楚，尚需进一步研究。

miRNA是一类在真核生物中广泛存在的、在进化上高度保守的小分子非编码RNA，可通过作用于相应靶信使RNA，参与细胞增殖、分化、凋亡等生物学行为。miR-143-3p是miRNA家族成员之一，是一种潜在的肿瘤调控因子，通过调控细胞周期调节细胞增殖或凋亡，在恶性肿瘤中发挥致癌或抑癌基因作用[6]。有研究报道，miR-143-3p可通过直接靶向抑制Bcl-2、IGF-1R表达，抑制鼻鳞状细胞癌细胞增殖和迁移[15]；miR-143-3p还可通过靶向FGF1促进肝癌细胞凋亡，抑制上皮间质转化[16]。但在原发性肺癌脑转移组织中miR-143-3p表达上调，miR-143-3p可通过靶向Vasohibin-1 3′非翻译区增强肿瘤细胞的血脑屏障侵袭能力，促使肺癌脑转移[5]。本研究结果发现，miR-143-3p在胃癌组织中表达下调，并且其表达与胃癌组织分化程度、浸润深度、pTNM分期、淋巴结转移以及患者预后有关。提示miR-143-3p可能作为抑癌基因参与胃癌的发生、发展，与牛荣等[17]研究结果基本一致。究其原因，miR-143-3p能够直接靶向抑制抗凋亡基因AKT2表达，抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移[18]，或通过靶向环氧合酶2诱导胃癌细胞凋亡[19]。

本研究结果还发现，胃癌组织lncRNA MAFG-AS1表达与miR-143-3p表达呈负相关关系，提示lncRNA MAFG-AS1可能通过负向调控miR-143-3p表达参与胃癌的发生、发展。LI等[20]研究发现，在膀胱癌细胞中lncRNA MAFG-AS1通过靶向miR-143-3p调节环氧合酶2表达，促进膀胱癌细胞增殖、侵袭和迁移。陈军芳等[21]研究报道，lncRNA MAFG-AS1可通过调控miR-143-3p/AKT2轴促进胃癌细胞增殖。

综上所述，胃癌组织lncRNA MAFG-AS1表达上调、miR-143-3p表达下调，二者表达变化与胃癌恶性生物学行为和患者预后不良有关。但lncRNA MAFG-AS1是否通过负向调控miR-143-3p表达参与胃癌的发生、发展尚需进一步研究。