不同玉米自交系的低氮应答分析

徐金铭，金 戈，李 超，于晓明

（吉林农业科技学院，吉林吉林 132101）

0 引言

作物的高产和稳产，离不开氮肥的生产和利用，甚至作物产量的50%左右都受到氮素的影响。玉米是高需氮作物，氮的吸收利用效率与玉米的产量直接相关。可通过发掘有效氮响应基因和繁育低氮耐受玉米品种，提高贫瘠地区玉米产量[1]，氮肥的合理使用会极大为玉米生长提供充足的营养物质，最终会决定作物的总产量[2]。农业生产中通常存在的现象是氮肥施用量大造成浪费。使用的大量的氮肥不仅没有使产量有实质的提升，相反的是造成了极大的资源浪费和对环境有了恶劣影响，这并不不利于农业的可持续发展[3]。据统计，全球的氮肥消耗量中，中国超过1/3，且氮肥的使用严重超标，更严重的是氮肥利用率偏低，只有30%左右[4]。分析玉米低氮耐受性形成的机理，提高玉米氮利用效率，是解决上述问题的关键。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究使用的试验材料为玉米自交系B73和Mo17。

1.2 试验方法

1.2.1 玉米低氮处理。对玉米在水培条件下进行低氮条件培养（硝酸盐作为唯一氮源）。挑选大小一致、子粒饱满的种子，置于湿润滤纸上25℃发芽48 h；芽生长至0.5 cm左右时，选择出芽一致的种子去除胚乳，移入装有改良的Hoagland营养液（KNO3浓度为5 mM）中培养5天，电动气泵每天通气12 h；再分别以无氮（0mM KNO3）、低氮（0.5 mM KNO3）和正常（5 mM KNO3）营养液培养15天，然后称量玉米植株的干重、氮含量等。

1.2.2 玉米生理指标测定。我们检测了在低氮（0.5 mM KNO3）和正常氮（5 mM KNO3）条件下生长的B73和Mo17的不同生理指标，包括：总氮含量、硝酸还原酶（NR）活性、亚硝酸还原酶（NiR）活性。用Elementar isprime 100 vario EL（Elementar，German）测量总氮的量，使用Smartchem 450自动化学分析仪（Unitscience，USA）测定硝酸盐的含量。硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性检测分别使用NR和NIR分析试剂盒（Plant）（Jonln，China）完成。

1.2.3 基因表达分析。对V1期玉米植株进行正常氮（5 mM KNO3）和低氮处理（0.5 mM KNO3）24 h，提取植株总RNA。使用荧光实时定量PCR法，检测玉米硝酸还原酶基因ZmNNR1和ZmNNR2。反转录和荧光实时定量PCR反应参照Meng等人方法[5]，使用的内参基因为ZmACT1。

2 结果与分析

2.1 不同氮浓度条件下玉米自交系的表型分析

对发芽后5天的玉米植株进行不同浓度的氮处理：正常氮（5mM KNO3）、低氮（0.5mM KNO3）、无氮（0mM KNO3）处理，处理15天后比较两个自交系之间的生物量和侧根长。结果发现，外源氮素的减少影响了B73和Mo17生物量的积累（图1A）。值得注意的是，在正常氮和无氮条件下，自交系B73与Mo17的干重之间无明显差异；而在低氮的情况下，自交系Mo17的干重显著高于B73（图1）。上述结果表明，Mo17在低氮条件下比B73具有更快的物质积累速度。

2.2 不同氮浓度条件自交系的生理分析

硝酸盐是植物可溶性蛋白质和叶绿素合成的重要氮素来源，叶片总氮可以作为植物整体氮代谢状态的评价指标[7]。本研究对玉米叶片总氮含量检测发现，在低氮（0.5mM KNO3）条件下，自交系Mo17与B73的总氮含量有显著差异（P<0.05）；在正常氮（5mM KNO3）条件下，Mo17与B73的差异不显著（图1B）。

图1 不同氮浓度条件下的玉米干重、硝酸还原酶活性与基因表达分析

我们进一步分析了Mo17和B73中的硝酸还原酶活性，结果如图1C所示，在正常氮条件下，Mo17与B73中的硝酸还原酶活性的差异不显著；而在低氮条件下，Mo17的硝酸还原酶活性显著高于B73。对亚硝酸还原酶活性的检测发现，在低氮（0.5mM KNO3）条件和正常氮（5mM KNO3）条件下，Mo17与B73无显著差异（图1D）。上述结果表明，Mo17具有更高硝酸还原酶活性，从而使Mo17具有更高的氮利用效率。

2.3 不同氮条件下关键氮响应基因表达分析

因为Mo17中具有较高的硝酸还原酶活性，因此我们检测了Mo17和B73中的硝酸还原酶基因ZmNNR1和ZmNNR2的表达情况。结果发现，在正常氮和低氮条件下，Mo17中的ZmNNR1和ZmNNR2表达水平都显著高于B73（图1E，F）。这个结果表明，Mo17中硝酸还原酶活性的提高可能是ZmNNR1和ZmNNR2的高表达造成的。

3 结语

玉米是我国最重要的大田粮食作物之一，也是一种研究较多的遗传模式植物。本研究发现，玉米在低氮环境条件下，自交系Mo17的耐受性比B73明显提高。在低氮条件下，Mo17体内积累了更多的氮素，而且Mo17的干物质积累速度也均快于B73。

植物根部吸收外源的硝酸根后，进行还原反应的第一步是在硝酸还原酶的作用下将硝酸根还原成亚硝酸根。本研究进一步的生理分析发现，Mo17在低氮条件下具有更高的硝酸还原酶活性，这可能是Mo17对低氮的耐受性强于B73的主要原因。而且，对ZmNNR1和ZmNNR2基因表达的分析发现，Mo17中的ZmNNR1和ZmNNR2表达也显著高于B73。因此，我们认为Mo17表现出更强的低氮耐受性是由于其具有更高的硝酸还原酶基因表达水平，增强了体内的硝酸还原酶活性，从而提高了Mo17的氮吸收效率。