稗子用于微生物源生物除草剂筛选的研究

张志刚，王开梅，吴兆圆，万中义，方 伟

（湖北省生物农药工程研究中心/湖北省农业科技创新中心生物农药分中心，武汉 430064）

水稻田稗子［Echinochloa crusgalli（L.）Beauv］是一种难防单子叶杂草，受子粒较大、幼苗生长快、幼苗株型较大、敏感性差等不利因素的影响，在针对单子叶杂草的除草剂筛选中很少被利用。由于微生物源生物除草剂常具有较严格的专一性，所以微生物源生物除草剂筛选不宜用模式植物来替代防治目标，必须以目标杂草作为筛选靶标［1，2］。直接使用稗子进行微生物源生物除草剂筛选，可以提高筛选的针对性，减少漏筛［3，4］。由于微生物源生物除草剂使用带有培养基的活菌发酵液进行筛选，筛选过程中极易因杂菌污染引起假阳性，而稗子生长快、幼苗株型较大、对杂菌污染不敏感的特点在微生物源生物除草剂筛选中成为优点，可以降低假阳性率，并且延长可观察时间［5，6］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 稗子种子 水稻田稗子种子由湖北省生物农药工程研究中心养虫室提供，试验所用种子保存在冷库中，保存温度为4℃，该种子在低温保藏前已经过春化处理，发芽率大于95%；马唐［Digitaria san⁃guinalis（L.）Scop.］种子由湖北省生物农药工程研究中心养虫室提供，试验所用种子保存在冷库中，保存温度为4℃，该种子在低温保藏前已经过春化处理，发芽率大于70%。

1.1.2 培养基 琼脂粉由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产，型号DH010-4。培养土、珍珠岩均为市售。

1.1.3 试剂及标准样品 用于种子表面处理的试剂有75%乙醇、2%次氯酸钠溶液；常用溶剂有乙醇、无菌水、吐温-80，以上试剂均为市售分析纯试剂；化学除草剂标准样品为硝磺草酮（98%）；微生物源生物除草剂为放线菌H-39、真菌H-76。

1.1.4 发酵液 放线菌和真菌发酵液由湖北省生物农药工程研究中心微生物资源研究室提供。培养基配方编号为HB-M-15。

1.1.5 主要仪器、设备 DH-S10手持式组织匀桨机、旋转振荡器、电子移液器（MCE8k）、96孔组织培养板（深孔）、手持式喷雾枪（喷头出口直径0.5、1.5、2.5 mm）、日光灯管组（光照强度为4 000～10 000 lx可调）、人工气候室（光照时间、温度可调）、无菌操作台、游标卡尺、7 cm方形塑料花盆。

1.2 方法

1.2.1 稗子和马唐种子表面处理及筛选用培养板制备 称取60 g稗子种子，置于500 mL三角烧瓶中，先用75%乙醇浸泡30 s，再用2%次氯酸钠溶液浸泡10 min，最后用无菌水反复振荡、浸洗3次以上，在无菌操作台中自然干燥备用［7］。马唐种子处理方法同稗子种子。把经过高压灭菌后0.7%的琼脂加入到96孔组织培养板（深孔），每孔加入量0.4 mL，冷却后备用。把处理过的种子转接到琼脂表面，稗子接入种子量为6～8粒种子/孔，马唐接入种子量为10～12粒种子/孔［8，9］。

1.2.2 小型盆栽准备 采用小型盆栽的方法［10］，把培养土和珍珠岩按3∶1的体积比混合均匀，边搅拌边加适量水。分装到7 cm方形塑料花盆中，备用。将“1.2.1”中处理过的种子播种到花盆的四角区域，马唐和稗子各占2个角，每个角上播种量均为10粒。喷适量水，覆透光膜培养。培养条件：温度25℃，相对湿度70%～80%，每日光照12 h，光照强度6 000 lx。培养3 d后揭膜，检查种子出芽情况，盆中各角只保留7株长势良好的实生苗，备用。

1.2.3 不同苗龄的盆栽及96孔板准备 按照“1.2.2”的方法，分别在同一花盆中播种2种杂草。每天播种10盆，根据需要连续播种数天，得到不同苗龄的盆栽。按照“1.2.1”的方法，分别在96孔板中接入杂草的种子，每天分别接种3板，连续播种5 d后，得到0～4 d不同苗龄的96孔组织培养板［11，12］。苗龄定义：播种当天加入试验样品，苗龄为0 d；播种1 d后加入试验样品，苗龄为1 d；播种2 d后加入试验样品，苗龄为2 d。依此类推。

1.2.4 稗子和马唐在水琼脂表面涂布法中对除草剂标准样品的敏感性试验

1）活性评价指标。根据活性反应的不同，使用分级指标数（0、3、5、7、9）标记除草活性［13］。

2）对除草剂标准样品的敏感性试验。根据需要把各标准样品配制成母液，以含0.1%吐温-80的无菌水稀释成12个不同的浓度梯度。在组织培养板中加入不同量的各梯度样品液。各组织培养板中琼脂表面涂布样品溶液量为0.060 mL/孔，按“1.2.1”的方法分别接入稗子和马唐种子。每个浓度设2个复孔，重复试验3次。培养条件：温度25℃，相对湿度70%～80%，每天光照9 h，光照强度6 000 lx。7 d后检查并记录结果，计算LC50。

1.2.5 稗子和马唐在小型盆栽喷雾法筛选中对除草剂标准样品的敏感性试验

1）活性评价指标。试验7 d测量并记录对照组及试验组株高，统计抑制率。为了便于持续观察与测量，本试验测量的株高值为植株地上部分的高度，叶片枯死部分长度不计入株高，植物死亡株高记为0。

2）不同苗龄的稗子和马唐对标准菌株的敏感性试验［14，15］。由于本次试验选用的化合物标准样品引起的作用是叶片黄化，所以对不同苗龄的盆栽喷雾试验只使用了标准菌株。以标准菌株的发酵液作为起始浓度，用吐温-80和无菌水稀释成适当的浓度。根据预备试验结果，放线菌H-39直接使用发酵液，吐温-80在样品中终浓度为0.1%；真菌H-76稀释到发酵液的0.4倍（0.4F），吐温-80在样品中终浓度为0.1%。喷雾样品量为1.5 mL/盆。每次试验设7株幼苗。重复试验3次。培养条件同“1.2.4”。7 d后检查并记录结果，统计平均株高抑制率。

2 结果与分析

2.1 不同苗龄稗子和马唐在水琼脂表面涂布法中对除草剂标准样品的敏感性

在化学除草剂筛选和除草剂活性生物测定中，马唐幼苗因株型较小且生长较慢，是一种被广泛选用的单子叶杂草模式靶标。由表1可知，就内吸性除草剂硝磺草酮而言，随着苗龄增加，马唐和稗子的敏感度降低，但降低的幅度有所不同。马唐在苗龄0、1、2 d时，其LC50基本保持在同一水平，分别为0.000 70、0.000 73、0.000 77 mg/mL，苗龄3、4 d时LC50约为前一苗龄的1倍；稗子在苗龄0、1 d时，LC50保持在同一水平，分别为0.002 80、0.002 70 mg/mL，苗龄2、3、4 d时LC50与0、1 d相比有较大幅度增加，分别约为苗龄0、1 d时的4、8、14倍。稗子苗龄为0 d时，化学除草剂硝磺草酮LC50为0.002 8 mg/mL，约为相同苗龄马唐LC50的4倍。就生物除草剂而言，同样随着苗龄增长，马唐和稗子的敏感性都呈下降趋势。其中对马唐活性较低的生物除草剂H-39，其最高浓度（发酵液）对苗龄为0 d的稗子只显示微弱的活性，无法统计LC50。对马唐活性较高的生物除草剂H-76，稗子苗龄为0 d时，其LC50为0.470 0 mL/mL，约为相同苗龄马唐LC50的15倍。由此可见，与马唐相比较，稗子在水琼脂表面涂布法筛选中的敏感性低，不宜用于生物除草剂的资源筛选。

表1 除草剂标准样品对不同苗龄稗子和马唐的LC50（7 d）

2.2 不同苗龄稗子和马唐在小型盆栽喷雾法筛选中对生物除草剂标准样品的敏感性

2.2.1 不同苗龄稗子和马唐株高和叶片数的增长特点 单子叶杂草的叶长增长和叶宽增长并不同步，如图1a、图1b所示。新叶生长前期，稗子苗龄2～5 d和马唐苗龄2～4 d，新叶快速伸长引起株高快速增长。新叶生长中期叶长伸长速度变慢，稗子苗龄5～6 d和马唐苗龄4～5 d，而叶宽快速增长。新叶生长后期，稗子苗龄6～7 d和马唐苗龄5～7 d，叶长和叶宽增长趋于停止。至下一片新叶长出，新叶又重复上述长势。新叶生长初期，叶形细长，对样品药液吸附差，喷雾后叶片上药液附着量少。

图1 不同苗龄稗子和马唐株高和叶片数的增长特点

2.2.2 不同苗龄稗子和马唐在小型盆栽喷雾法筛选中对生物除草剂标准样品的敏感性 根据单子叶杂草株高增加较快的特点，本试验选择株高抑制率作为活性评价指标。由图2可以看出，1～21 d苗龄的稗子和马唐对生物除草剂标准样品的敏感性呈规律性变化。低苗龄的稗子和马唐对生物除草剂都不敏感。随着苗龄的增长，稗子和马唐对生物除草剂的敏感性渐增，达到峰值后开始渐减。且马唐对生物除草剂标准样品的敏感期较稗子长。以株高抑制率大于40%的苗龄持续时间为基准，H39和H76对马唐的有效天数分别为16 d和13 d，H39和H76对稗子的有效天数均为6 d。马唐对标准样品的活性反应较稗子强，生物除草剂标准样品对马唐和稗子的株高抑制率峰值分别约为80%和60%。

图2 生物除草剂对稗子和马唐株高的抑制率

3 小结与讨论

由于生物除草剂具有专一性和更强的选择性，所以生物除草剂的筛选相对于化学除草剂的筛选，优先考虑的是筛选靶标和防治对象的一致性，其次才是选择具有高敏感性的模式靶标。稗子是中国水稻田最重要的恶性杂草，在田间药效试验中是必选的防治对象，但在除草剂资源筛选中却鲜被选择。因此，针对稗子的除草剂研究过程缺失了一个重要的环节——资源筛选。本试验结果表明，与常用除草剂资源筛选的模式靶标马唐相比，稗子对除草剂的敏感性较低。尤其是在用于除草剂高通量筛选的96孔微孔板法中，生物除草剂对稗子的抑制率约为马唐LC50的15倍以上。较低的敏感性引起的直接后果是活性样品检出率低，造成资源的浪费。但是在小型盆栽喷雾法试验中，生物除草剂标准样品对马唐和稗子的株高抑制率比较接近，抑制率的峰值分别约为80%和60%。应用小型盆栽喷雾法，在精准控制苗龄的前提下，稗子在除草剂资源筛选中的敏感性可以达到与常用模式靶标——马唐的敏感性接近，这是以稗子为防治目标的生物除草剂资源筛选的一个转机。在田间防效试验中，稗子的敏感性高于马唐［16，17］。主要与试验对象的苗龄有关。在室内除草剂资源筛选中，为了提高筛选通量和试验的可操作性，常选用苗龄较低的杂草进行试验。由于大于21 d苗龄的稗子株型较大，不适于实验室操作，所以本试验选择的苗龄是1～21 d。21 d苗龄以后，是否还存在对微生物源生物除草剂高敏感的波峰还有待进一步研究。