单分子成像和追踪技术在工业微生物研究中的应用*

严少敏，吴 光

(广西科学院，国家非粮生物质能源工程技术研究中心，非粮生物质酶解国家重点实验室，广西生物质工程技术研究中心，广西生物炼制重点实验室，广西南宁 530007)

0 引言

随着环境保护和可持续发展的强烈需求，绿色制造备受关注。现代科技的迅猛发展提升了生物工程、代谢工程、合成生物学等领域的创新能力，工业微生物的应用也日趋广泛。然而，作为生产单元的底盘细胞，活的微生物菌株不断对生产过程中的各种应激做出响应，难以在整个培养期间保持最大的生产能力，导致在经济效益上无法满足产业化的要求。这个制约微生物细胞工厂发展的瓶颈问题，对酶学研究提出了新的挑战。

单分子成像和追踪技术具有独特的监测优点，可对活体生物实施直接、准确、实时的观察，实现对单分子酶催化过程的实时监控。这些技术的应用使多种酶的新单分子行为及反应机制被发现，促进了各种新型酶、新特性酶、新作用方式酶的研发。在各种单分子工具和技术中，单分子荧光显微镜技术脱颖而出，它能够高特异性地监测荧光标记的生物分子的时空行为，成为研究生物系统的有力工具。

目前，在工业微生物及酶工程领域的研究中，单分子成像和追踪技术的应用亟待提高。本文从单分子成像和追踪技术的主要特点(以荧光显微镜为主)及其在微生物研究和酶学研究中的应用，在工业微生物研究中的应用和挑战等4方面探讨了相关内容，旨在推动酶的工程改造，提高细胞工厂的生产能力。

1 单分子成像和追踪技术的主要特点

单分子工具和技术涉及面广，包括原子力显微镜、单分子荧光显微镜、光镊、磁镊、纳米孔镊以及增加可观察物数量的混合技术[1]。这些方法可以通过施加力和力矩，操纵单个生物分子，观察单个运动复合体的动态构象变化。其中荧光显微镜具有极高的对比度、标记的特异性、对生物样品的干扰相对较小的特点，伴随着监测器、染料技术和图像分析方法的技术进步，单分子荧光显微镜技术脱颖而出，成为研究生物系统的有力工具，因为它可以高特异性地监测几乎任何荧光标记的生物分子的时空行为。这样的“超分辨率”显微技术，就是以比光学分辨率极限更高的精度呈现空间信息的光学成像技术[2]。

实现超分辨率的最简单方法是避免在远场区域成像，执行近场成像(即荧光源和检测器之间的距离小于几个波长的光)，从而避免受到显著的光学衍射效应的影响。单分子定位显微镜具有两方面功能，单分子成像能够在纳米尺度上解析生物结构，单分子追踪可以在毫秒范围内监测分子间相互作用。其基本工作原理是通过控制单个荧光团的荧光发射，实现比传统荧光显微镜方法更高的分辨率。随着时间的推移，通过“闪烁信号”策略可以获得不同小荧光团子集的图像，并且可以高精度定位每个单独荧光信号的质心，以创建详细的分子图和纳米尺度的超分辨图像[3]。

单分子定位成像中最常用的荧光团是荧光蛋白和有机染料。荧光蛋白具有遗传标记的优势，具有β-桶状蛋白结构保护中间的发色团。有机染料通常比荧光蛋白提供更高的荧光量子产率，并且可以在化学合成过程中定制。例如，通过不同离域的π-电子系统设计微调其光谱性质，通过增加发色团两侧的基团来增加其溶解度和光稳定性。此外，由于可以添加可变标签组，有机染料的应用非常灵活[3]。

英国约克大学生物物理科学研究所的Shashkova和Leake总结了单分子荧光显微镜技术的主要特点及其应用[2]，相关内容见表1。北京大学生命科学学院的孙育杰团队总结了5种单分子成像显微镜的成像模式[4]，相关内容见表2。

表1 单分子荧光显微镜技术的主要特点

续表1

续表1

表2 5种单分子成像显微镜的成像模式

2 单分子成像和追踪技术在微生物研究中的应用

活体微生物细胞内蛋白质研究经历了细胞整体、单个细胞、亚细胞、低拷贝单分子、任意低拷贝单分子的发展过程[5]。在活的微生物细胞中实现单分子检测存在三大障碍，即受到灵敏度、空间分辨率和光稳定性的限制。

绿色荧光蛋白(GFP)的出现，提供了一种标记蛋白质的简单的基因方法，该方法能够标记细胞中许多不同的生物分子，使对细菌的研究从群体研究快速过渡到单细胞研究，实现了许多细菌蛋白质、染色体和质粒DNA以及膜结构的亚细胞分布的成像，成为微生物研究中的里程碑[6]。对活细菌进行的第一次单分子荧光研究使用了荧光探针的多个拷贝，检测细胞中的信使RNA(mRNA)分子。一个流行的系统依赖于RNA发夹和MS2噬菌体衣壳蛋白之间的高亲和力相互作用；通过在相关mRNA中引入发夹的多个重复序列，并表达与GFP衍生物融合的MS2蛋白，可以间接地用GFP标记mRNA分子。

在裂变酵母中，将一种快速成熟的黄色荧光蛋白(YFP)基因与一种膜定位蛋白片段(Tsr)的染色体拷贝进行基因融合，通过lac操作子控制YFP-Tsr基因的转录和翻译，检测新合成的荧光蛋白质，定位并追踪其扩散，建立一个可以恢复活细胞内基本过程的定量信息，可以直接在细胞中测量蛋白质的位置、拷贝数及其出现的时间[7]。

双标记系统通过DNA结合蛋白与插入细菌染色体或质粒的特定DNA序列基序的相互作用来“标记”DNA上的特定位点。例如，荧光阻遏算子系统(基于转录阻遏，如lacI和tetR)；parB-parS系统(基于质粒分割蛋白parB，在染色体中引入的parS位点上的结合和随后的扩增)。多探针方法在单分子微生物学研究中被广泛应用，包括分析细菌染色体中核糖体RNA操纵子的三维结构，DNA复制过程中复制叉的运动，细菌质粒的流动性和位置，染色体重组，动力学的直接研究等[5]。

单分子成像和追踪技术已广泛用于微生物研究中，包括DNA修复[8-10]、转录机制[11-13]、膜生物学[14]、类核结构[11,15,16]、细胞分裂[3,15,17-19]、胞吞作用[20]、纤毛结构[21]、分泌系统[22,23]、生物膜[24]等许多方面。分子计数的一个重要扩展是研究在细胞分子机制中组装(稳定或瞬时)的蛋白质组分的数量，即大分子机器的亚单位化学计量，通过在体内追踪单个蛋白质，直接测量体内反应时间，研究分子间的相互作用。例如，通过鞭毛将含有MotB-GFP染色体拷贝的细胞表面固定化，并通过亮场和全内反射荧光显微镜交替观察细胞的旋转[25]。

单分子追踪的数据分析丰富了观察信息。如追踪光激活定位显微镜，提供了定位和追踪的数量作为感兴趣蛋白质拷贝数的估计值；通过分析径迹内的位移来计算每个径迹的表观扩散系数(考虑二维扩散)，可以恢复蛋白质扩散过程；从属于不同迁移组的蛋白质分子轨迹的相对位置推断出大量的空间信息；蛋白质迁移不同模式之间的转换可提供生化反应或结合动力学的信息[5,26]。

3 单分子成像和追踪技术在酶学研究中的应用

对于酶工程领域来说，酶学研究正处于一个拐点。在分子生物学技术的推动下，酶工程技术获得了突破性的发展，通过开创性地借助分子生物学的方法进行快速而广泛的分子定向进化，从而改变酶的功能或特性，推动了酶工程的应用价值[27]。而且，改良的DNA技术、各种生物信息学中的新工具，以及新时代对“绿色催化”的强烈需求，都推动和促进了酶工程的发展[28]。对酶制剂的需求不仅局限在传统领域，在新兴领域酶制剂也获得了广泛应用[29]。制药、环境、精细化学品等领域对酶制剂的迫切需求，推动和促进了各种新型酶、新特性酶、新作用方式酶的研发[6]。这些研发涉及创造新的，通常是具有非天然催化活性，或者非天然底物反应等的新酶。这些新酶的研发可以为使用化学合成工艺的传统制药领域带来新的、可持续的绿色催化工艺，而且可以引入更具有特异性的催化路线[30]。然而，这对研发新特性酶的酶工程而言提出了更大的挑战。

在现阶段，酶学研究和酶工程改造通常依赖于已知酶的蛋白质结构。例如，纤维素酶的蛋白质工程主要有两个趋势：第一，计算蛋白质工程的结果对于推动该领域的研究越来越重要，因为实验设想和结果仍然很少；第二，进一步研究纤维素水解的辅助蛋白，如溶解性多糖单加氧酶(LPO)，以改进纤维素酶的属性和结构[31]。由于蛋白质结晶和蛋白质结构解析的工作费时费力，大部分酶都没有提供蛋白质结构信息[32]，因此，以往在对酶分子改造的研究中，假设在反应条件下(低酶浓度、高底物浓度、有机溶剂等)酶的结构与结晶酶(高酶浓度、无底物和/或有机溶剂)的结构非常相似，在此基础上进行各种研究。实际上，酶在不同条件下的分子作用方式差异极大[33]，根据结晶酶及其催化反应条件等来设计酶的改造策略往往是失败的。

因此，对于酶工程研究来说，急需一种快速直接的蛋白质特性分析手段，为酶工程改造提供技术支撑。单分子成像技术具备这个优势。利用单分子成像可以直接对单分子酶的催化过程实时监控，直接观察到蛋白质在各种不同条件下的作用方式，特别是单个蛋白质的各种氨基酸残基的作用力学变化，这个优势使得研究人员可以根据每个催化反应来观察分子变化，从而加速了催化策略或分子改造策略的实施方案[34,35]。

单分子酶蛋白质研究是新近随着分析仪器的更新和进步，在生命科学领域开拓出来的新热点和新技术手段。生物学中的各种反应，都是由单个分子的各种反应聚集而成的宏观现象。实际上，分子相互作用和化学反应总在单分子水平上发生，但由于研究手段的限制，各种化学反应和生物反应的数据几乎都是从含有大量分子的实验中得到。对于由微观汇集成宏观的生物反应过程，利用传统的研究手段无法触探到反应的本质，只能是采用间接的方法，通过宏观的现象变化推测分子级别的反应特性。

随着生命科学中分析仪器和分析技术的发展，对单个分子进行分析成为可能。从20世纪90年代中期开始，许多研究人员转向室温单分子检测，尤其是生物体系的单分子研究，实现了对活细胞单分子生化反应的高特异性、毫秒时间分辨率的探测。在过去的十年中，科学和技术的进步使生物催化成为实验室和工业规模化学合成中，传统金属和有机催化实用和环境友好的替代品。随着DNA测序和基因合成技术取得的关键进展，在通过蛋白质工程和设计裁剪生物催化剂以及将酶重组为新的生物合成途径的能力方面取得了巨大进展[36]。由于单分子技术具有避免集群研究的平均效应、捕获瞬态中间产物和表征非均一行为等优势，科研人员得以触探到生物反应的本质变化，从而使生物学的许多领域取得重要突破。

利用单分子成像和追踪技术在研究酶和DNA的相互作用方式中，诞生了单分子测序方法，即现在所称的第三代测序技术。单分子测序不需要任何PCR的过程，有效避免了以前的测序方法因PCR偏向性而导致的系统错误，同时具有提高读长，并保持二代技术的高通量、低成本的优点，从而实现了技术上的大跨越。利用单分子原理的测序技术仪器也得到推广，并且逐步取代在2008年才面世的第二代测序仪器，进入第三代测序时代[37]。

单细胞基因组学通过单分子技术与基因组学的交汇，实现在单细胞中检测基因拷贝数以及单个点突变。与此同时单分子成像和追踪技术用于追踪运动轨迹，探明细胞中单个分子或单个粒子的运动表现[38]。所以，单分子实验的研究结果不仅是对以往总体平均研究方法的有力补充，而且在许多方面单分子技术已成为深入研究酶的生物活性不可或缺的手段。

单分子成像和追踪技术在酶工程研究中得到应用，如对分子马达机械力化学耦合的深入分析使人工工程马达的发展成为可能。分子马达是一种将化学能转化为机械能的酶，在这种酶的作用下，它可以执行关键的细胞功能，如DNA复制和转录、DNA超螺旋、细胞内运输和ATP合成。单分子成像和追踪技术已被广泛用于识别分子马达反应循环中的结构中间体，并了解能量消耗的子步骤如何驱动中间体之间的转换。这些技术被应用于研究各种马达，如螺旋酶、DNA和RNA聚合酶、拓扑异构酶、核小体重组子，以及参与DNA缩合、分离和消化的马达[1]。通过突变、化学修饰和光遗传学等技术，重新设计现有的分子马达，例如改变速度、过程性或功能性[1,39]。

基于单分子成像和单分子生物学的研究结果，实现了在活细胞里直接观测生物大分子。中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室的研究团队鉴定了两种核酸内切酶缺陷、单组分可编程RNA引导和RNA靶向Cas13 RNA酶(dCas13)，可对活细胞中的RNA进行稳健的实时成像和跟踪。dCas13和dCas9(Cas9的突变形式，其内切核酸酶活性通过点突变被去除)系统的进一步组合允许同时可视化活细胞中的基因组DNA和RNA转录[40]。

使用纳米拷贝技术可以放大单个标记基因，从而能够在拥挤的细胞内环境中，在可寻址的亚衍射体积中进行单分子检测，实现以单分子分辨率对RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)进行成像、跟踪和量化，揭示其在转录周期中的动态，并进一步研究多个功能相关事件—调节因子—染色质相互作用、Pol Ⅱ动力学和新生转录动力学，揭示了迄今为止在体内未发现的基因调控机制的详细操作参数[41]。此外，一种基于纳米结构的双色荧光探针，通过双色共定位成像提高了测量精度，从而大大避免了假阳性信号，并实现了活细胞中微小RNA的实时原位成像，推进了在单分子水平上对活细胞中各种生物分子进行无酶放大监测和成像[42]。

4 单分子成像和追踪技术在工业微生物研究中的应用和挑战

随着生物工程技术和计算机辅助设计的迅猛发展，工业微生物的应用日趋广泛。近年来，新的合成生物学方法提高了原始菌株的高附加值次级代谢产物的产量，新的生物合成基因簇的挖掘和构建开辟了工程菌株的应用途径[43]。代谢工程提供了以可再生方式生产新分子的极好能力，拓宽了通过细胞系统从化学元素合成有用产品的范围，加速了生物燃料、生物材料和纳米技术的应用[44]。但是，随着培养条件和细胞状态的动态变化，底盘细胞不能在整个培养期间保持最大的生产能力，在经济效益上不能满足产业化的需求，成为制约微生物细胞工厂发展的瓶颈。

工业微生物在发酵过程中通常作为活细胞催化剂，常用的工业微生物有细菌、放线菌、酵母菌和霉菌。单分子成像和追踪技术在工业微生物研究中得到了应用。德国马克斯普朗克陆地微生物研究所的研究团队详细总结了单分子成像和追踪技术在微生物研究中的应用现状特点[3]，归纳为图1。从图1可见该领域的研究现状有以下特点：①单色研究为主，多色研究尚不多见；②大多数研究在模式微生物中进行；③结构成像较多，单粒子追踪很少；④大多数研究按时间顺序记录不同的靶点，并行成像较少；⑤在各种标记方法中，最主要的是基因标记，特别是荧光蛋白融合；⑥成熟的多色标签不多。因此，单分子成像和追踪技术在工业微生物研究中的应用仍处在起步阶段，这是因为其在实际应用中面临诸多挑战。

图1 单分子成像和追踪技术在微生物研究中的应用现状

微生物细胞是小而密集的单细胞有机体，其特点是具有强大的细胞壁保护，特定的自体荧光或彩色色素背景，蛋白质的拷贝数相当低，生长速度和新陈代谢速度却相当快[3]。在微生物细胞中进行单分子检测是一项复杂的工作，这是因为其中存在复杂的扩散模式；许多荧光蛋白倾向于寡聚，扭曲的相互作用会使蛋白质的定位和聚集状态发生改变；在同一个细胞中进行双色/多色测量，共定位检测技术相当复杂；准确计算分子数量是复杂的，可能出现计算不足或过多的情况，需要有每个特定的荧光蛋白在特定的细胞环境中检测效率的知识。

蛋白质完全荧光融合的方法在应用中仍然存在限制，难以处理中到大拷贝数的蛋白质，因为它们会使典型的细菌细胞过于荧光“拥挤”，因此很难研究大多数蛋白质在活细菌中的自然拷贝数行为。对低拷贝数的需求也妨碍了从单个细胞收集大量统计数据，从而限制了研究分子异质性的机会，这种异质性可能反映化学异质性(共价或非共价)或不同的细胞环境[5]。

标记分子的正常生理功能可能受到干扰。例如，在DNA上标记标签可能会干扰局部染色质的结构和功能；内切酶(TALE，Cas9)或抑制物与染色质的结合可能干扰基因转录；将多个适配体外壳蛋白标记到单个mRNA会显著增加mRNA的大小，从而干扰转运动力学；蛋白质标记的潜在缺陷可能源于内源性标记和外源性标记分子之间的差异；大多数单分子成像都是在外源蛋白上进行，由于靶蛋白的过度表达，很可能会产生人为的效应。CRISPR/Cas9系统等基因工程技术可以有效地将标记模块插入靶标分子的内源性基因组位点，使融合分子在生理水平上表达，实现在生理相关水平上对靶标分子进行成像[22]。

荧光探针的不理想性能和光毒性，可能导致对单分子数据的不精确甚至不正确解释。蛋白质停留时间的计算取决于标记荧光团的光稳定性，胞内成像所需的标记性能与现有的探针相比还有很大的差距，长期、连续、快速、低光毒性的单分子成像需要更明亮、更稳定、更简单的探针和标记方法，有待开发用于活细胞单分子成像的优秀探针。进一步优化非传统荧光团，例如纳米体、量子点、共轭半导体聚合物点和碳纳米点，可能成为活细胞单分子成像的优秀探针[4]。

对于单分子动力学和细胞行为之间的联系，目前大多数实验都是在体外培养的细胞系上进行，由于光的散射，很难在生物体内实现单分子成像。另外，组织细胞在培养皿中的培养和驯化可能引起细胞性状和组织成分的改变，可能会导致对结构与功能关系的误解。大体积的高速成像是光片显微技术进一步发展的重要方向，自适应光学、光片显微镜和明亮的基因编码标签的结合将使单分子成像更加深入[4]。

当底物和酶以很低的拷贝数存在时，还应考虑生化反应的波动，许多过程具有区隔效应，在限制拷贝数的过程中多功能蛋白质之间存在竞争，无法复制构成活细胞自然环境复杂的生物分子混合物[5]。

现有的成像工作已是“大数据”项目，所提供的大数据集，需要复杂的图像和时间序列分析来探测蛋白质的位置和流动性。大数据集的可用性以及定量的、统计上可靠的、基于成像的活体内分子特性信息，从活体内的分子扩散到复杂的基因网络和分子机器的功能，也为构建描述许多过程的数学模型提供了极好的输入[45]。伴随着合成生物学家生产的工程合成细胞、成像分辨率和通量的提高，将进一步扩大数学模型的应用范围。

许多因素会影响微生物细胞内单分子成像的性能，需要进一步提高单分子成像的性能。可通过扩展研究方法，如改进的荧光团和标记方法，高级微拷贝、分辨率更高、内容更丰富、照片损伤更低的成像技术，力传感器，微流体，数据分析程序，数学建模等，增强单分子成像的能力和适用性[46]。

所有使用的单分子工具都已接近当前的技术极限。在用纳米技术研究纳米生物学问题时，每一项新技术的发展和应用都离不开方法的改进。一个悬而未决的问题是如何追踪动态、协同移动的交互靶标。探针的发展可能改变当前的技术限制，包括研发能长时间和更精确地追踪不同微生物靶点轨迹，能标记更小靶点的探针，不干扰细胞生物学，高标记密度和效率的探针[3]。

采用尽量减少样品体积，设计光稳定性更好的荧光蛋白新变体，提高相机探测器的灵敏度，以提高信号的检测能力。开发各种分析工具来提高信噪比，如细胞图像的自动“分割”方法，用于追踪荧光标记分子的稳健软件算法，追踪分子形成的分子络合物的化学计量分析。

对细胞工厂中生产单元的细胞进行单分子成像分析，可借助微流控装置，控制菌细胞的大小或形状，将细胞引入不同的微环境，测试对环境暴露的反应，或监测不同菌株之间的相互作用(合作或对抗)[46]。

5 展望

单分子成像和追踪技术实现了对细胞内部生命的直接可视化和原位测量，对理解生物过程至关重要，在生物学研究中带来了许多深刻的发现。单分子成像和追踪技术在工业微生物中的研究仍处在起步阶段，在实际应用中仍面临诸多挑战。展望未来，单分子成像和追踪技术的应用必将促进纳米生物学的发展，推动酶工程改造，提高细胞工厂的生产能力。