5种植物内生菌的分离及其拮抗月季黑斑病菌的筛选
2022-01-07宋光桃付美云张惠颖吴玉红田伟政
宋光桃，付美云，张惠颖，吴玉红，田伟政
（1.湖南环境生物职业技术学院a.园林学院；b.林下药用植物应用技术湖南工程研究中心，湖南 衡阳 421005；2.中南林业科技大学生命科学技术学院，湖南 长沙 410004）
月季花（Rosa chinensisJacq）是衡阳市的市花，也是中国的十大传统名花之一，被誉为“花中皇后”［1］，在城市园林绿化中，有着不可或缺的价值。月季黑斑病是月季的主要病害和常见病害［2］。发病严重时月季全株仅剩下光秃的枝条，既降低了月季的观赏和经济价值，还能导致月季过早衰败［3］，甚至植株死亡［4］。目前生产上常用化学药剂进行防治［5-10］，由于化学防治存在农药残留和环境污染等诸多不足，近年来生物防治已被人们广泛重视。
植物内生菌在植物体内具有相对稳定的生存空间，不容易受到外界环境的影响，并能产生多种抗菌生物活性物质，已经成为一类重要的微生物资源被用于植物病害的防治［11］。国内外对内生菌在植物病害防治方面的研究已经有许多报道［12-15］，但在月季黑斑病防治上未见报道，本试验尝试从5种植物中分离内生菌，并筛选出对月季黑斑病防治效果较好的菌株，为月季病害无公害防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试病原菌菌株来源
从衡阳市南湖公园及湖南环境生物职业技术学院月季植株上采集具有典型月季黑斑病症状的病叶组织，以常规组织分离法进行病原菌的分离，在PDA培养基上28℃下暗光培养，获得的分离物经纯化后，在PDA斜面培养基上培养并于4℃低温保存备用。
1.1.2 供试拮抗菌菌株来源
从衡阳市南湖公园及湖南环境生物职业技术学院月季植株上取健康叶片，在湖南环境生物职业技术学院院内及附近取银杏、钩腾、黑老虎、山苍子健康叶片。
1.1.3 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(NA)、高氏一号培养基等，用于病原菌与拮抗菌的分离、纯化和保存、拮抗性测定和培养性状观察。
1.2 方法
1.2.1 月季黑斑病菌的分离
采用常规组织分离法分离病原菌，在28℃下培养，得到的培养物经纯化后保存备用，并制片在显微镜下观察分离物形态。
1.2.2 月季黑斑病菌的致病性测定
采用伤口接种法把月季黑斑病菌孢子悬浮液接种至健康的月季叶上，实验重复3次，并设对照；待症状出现后，切取发病处组织，再用常规组织分离法分离病原菌，把所得病原菌纯化培养、保存备用，并制片在显微镜下观察病原菌的形态。
1.2.3 内生菌的分离
（1）组织表面消毒。将采集的新鲜健康月季、银杏、钩腾、黑老虎、山苍子的叶组织取材后，用自来水冲洗干净，70%的酒精浸泡3～5 s，再用0.1%的升汞浸泡3 min进行表面消毒处理，用无菌水冲洗3～4次，并作印迹对照处理［11］，检测植物表面消毒是否彻底。
（2）分离纯化方法。将消毒后的材料放于经灭菌的盛有少量石英沙的研钵中磨碎（加入5 ml生理盐水），取上清液梯度稀释到浓度为10-1～10-2，取0.1 ml涂布于相应平板上（细菌用NA平板，放线菌用高氏一号培养基平板，真菌用PDA平板），重复3次，置于25℃恒温箱中黑暗培养。待涂布平板上长出菌落后挑取菌株，转接于新鲜培养基上，经纯化后转入斜面试管培养，放线菌和真菌培养3～5 d，细菌培养24 h后，4℃保存、备用。
1.2.4 拮抗菌的初筛
（1）拮抗细菌初筛：在PDA平板中央分别接种直径6 mm的月季黑斑病菌菌饼，在周围2.5 cm处接种分离的细菌，每皿接1株细菌，对称接3点，重复3次。置于25℃恒温箱中培养，同时以不接细菌为对照。当对照长至培养皿边缘时，测量抑菌圈大小。
（2）拮抗放线菌与真菌初筛：以月季黑斑病菌作为指示菌，采用平板对峙培养法进行筛选。将PDA培养基融化倒成平板冷却凝固后，在平板中央分别接上月季黑斑病菌菌饼(直径为6 mm)，周围35 mm处等距离接4株不同放线菌与真菌菌饼(直径为6 mm)。以中央只接月季黑斑病菌，周围不接放线菌与真菌做对照，25℃培养6 d。每处理重复3次。观察放线菌与真菌各菌株的抑菌效果，选出对月季黑斑病菌有抑菌圈的放线菌与真菌菌株作为复筛菌株。
1.2.5 拮抗菌的复筛
（1）拮抗细菌复筛：把上述抑菌圈半径在5 mm以上的细菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在30℃、140 r/min条件下振荡培养3 d。在PDA平板中央用直径6 mm的打孔器打一孔，取出培养基，在孔内注入20µl上述的拮抗细菌发酵液，在周围距孔3.0 cm处接种供试病原菌菌饼。25℃恒温箱中培养，同时以不接拮抗细菌单独只接供试病原菌为对照。当生长快的病原菌对照长至培养皿边缘时，测量抑菌圈大小。
（2）拮抗放线菌复筛：采用平板对峙培养法，在平板中央接种上述初筛的拮抗放线菌菌饼(直径为6 mm)，在周围35 mm处等距离接种供试病原物菌饼(直径为6 mm)。以中央只接病原菌，不接放线菌做对照，25℃培养6 d。每处理重复3次。观察放线菌各菌株的抑菌效果。
2 结果与分析
2.1 月季黑斑病病原菌的分离与初步鉴定
用常规组织分离法从月季黑斑上分离得到3种真菌。
（1）月季炭疽菌（Colletotrichumsp.）：此菌是优势菌，分离时出现最多，在PDA培养基平板上菌落棉絮状，边缘完整，初期灰白色，随后菌落中央变为深灰色，并有粉红色分生孢子堆出现，分生孢子无色，单胞，长椭圆形（见图1，其中左边图A示分生孢子，右边图B示菌落）。将其分离物接种于健康月季叶上，一段时间后出现发病症状，其特点与初始感染月季黑斑病的病叶症状相似（见图2），对照没有出现症状。将接种发病的病叶再一次分离，所得病菌的形态与第一次分离得到的分离物形态一致。后期拮抗试验以此菌为试验对象。
图1 月季炭疽菌分生孢子形态(A)与菌落特征(B)Fig.1 Conidial morphology(A)and colony characteristics(B)of Colletotrichum sp.
图2 月季炭疽菌致病性测定Fig.2 Pathogenicity of Colletotrichum sp.
（2）月季链格孢菌（Alternariasp.）：此菌在分离时也常出现，在PDA培养基平板上菌落棉絮状，深灰色，边缘完整，分生孢子淡褐色或深褐色，有纵横隔膜，圆筒形、卵圆形、椭圆形或倒棍棒形（见图3）。将其分离物接种于健康月季叶上，一段时间后出现发病症状，其特点与初始感染月季黑斑病的病叶症状相似，对照没有出现症状。将接种发病的病叶再一次分离，所得病菌的形态与第一次分离得到的分离物形态一致。
图3 链格孢菌分生孢子Fig.3 Conidia of Alternaria sp.
（3）月季盘二孢菌（Marssoninasp.）：此菌在分离时不易出现，在PDA培养基平板上菌落灰白状，深灰色，边缘完整，分生孢子卵圆形或椭圆形，无色，双细胞（见图4）。将其分离物接种于健康月季叶上，一段时间后出现发病症状，其特点与初始感染月季黑斑病的病叶症状相似，对照没有出现症状。将接种发病的病叶再一次分离，所得病菌的形态与第一次分离得到的分离物形态一致。
图4 盘二孢菌分生孢子Fig.4 Conidia of Marssonina sp.
2.2 拮抗菌菌株的分离、纯化
采用涂布分离法，从健康月季、银杏、钩藤、黑老虎、山苍子的叶组织共得内生分离物69株，其中细菌分离物37株、放线菌3株、真菌29株（见表1）。从表1可知，69株内生菌中，月季分离物13株，银杏分离物14株，钩藤分离物12株、黑老虎分离物13株、山苍子分离物17株；只有银杏分离物中有放线菌。
表1 内生菌菌株分离结果Table 1 The results of endophytic strains isolation
2.3 拮抗菌的初筛结果
以优势菌月季炭疽病菌为目标菌，用对峙生长法测试了分离获得的内生菌对月季炭疽病菌的拮抗作用。结果显示，内生菌中有20株（细菌14株、放线菌2株、真菌4株）对月季炭疽病菌有拮抗作用，拮抗圈大于5 mm的有8株，其中细菌7株，放线菌1株（见表2）。真菌抑菌效果不明显。
表2 拮抗内生菌的初筛结果Table 2 The results of preliminary screening of antagonistic endophytes
续表
2.4 拮抗菌的复筛结果
以月季炭疽病菌为目标菌，用对峙生长法测试了初筛的7株拮抗菌的发酵液和1株拮抗放线菌对月季炭疽病菌的抑菌效果（见表3）。
表3 拮抗内生菌的复筛结果Table 3 The results of re-screening of antagonistic endophytes
由表2、表3可知，本次筛选没有得到抑菌效果较明显的真菌菌株，筛选出了对月季炭疽病菌抑菌效果最明显的细菌菌株是YJX2，它是从月季上分离的，放线菌菌株YXF1抑菌效果优于菌株YJX2，抑菌效果最好，但YXF1是从银杏上分离的，因此可将菌株YJX2与YXF1作为生物防治备选菌株进一步研究用于防治月季黑斑病。
3 结论与讨论
本试验用常规分离法分离了月季黑斑病菌，得到了3个不同菌株，其中炭疽菌为优势菌，并对3个病菌进行了形态观察与致病性测定，都能出现黑斑症状；从新鲜健康月季、银杏、钩腾、黑老虎、山苍子的叶组织内共分离得到内生菌中有20株（细菌14株、放线菌2株、真菌4株）对月季炭疽病菌有拮抗作用，拮抗圈大于5 mm的有8株，其中细菌7株，放线菌1株。复筛后细菌菌株YJX2，放线菌菌株YXF1抑菌效果较好，可作为月季黑斑病生物防治的备选菌株。
已有研究表明［16-19］，植物内生菌在植物体内与宿主植物形成了密切的互惠共生关系，具有多种抑菌功能，有些防病效果较明显，有一定的开发利用前景。本试验除月季外，还从4种药用植物（银杏、钩腾、黑老虎、山苍子）体内分离了内生菌，它们也有一部分内生菌能抗月季黑斑病菌，其中从银杏体内得到的放线菌菌株YXF1抑菌效果最好，它能否在月季上定植，还有待进一步研究。李玲玲等［20］从银杏茎叶中分离出多株真菌、细菌与放线菌，有多株菌株抑菌效果显著。本次分离的菌株YJX2与菌株YXF1的抑菌范围将进行下一步研究。另外，它们是否相互抑制也需后续研究。
