6种柳树对柳蓝叶甲的抗性鉴定及主要代谢物分析

李文杰，崔露露，麻芸娇，王春荣，郭娇娇，梁海永

(1 河北农业大学 林学院，河北 保定 071000;2 河北省林业和草原科学研究院，河北 石家庄 050061)

柳树是杨柳科柳属植物的统称[1]。柳树是我国比较常见的树木，其具有很高的经济价值，是重要的固堤、护岸、防风固沙和改良盐碱地的树种[2], 而且柳树易成活，生长快速，生物量大,可以作为很好的人工用材林及生物质能源林[3]。其具有诸多种植价值，不仅具有较高的绿化价值、园林价值以及观赏价值，同时也对空气污染以及尘埃具有良好的吸附能力。因此，其种植的范围也比较广泛，但是在柳树成长过程中容易受到各种病虫害的影响，而导致其生长质量受到影响[4]。其中主要虫害有柳蓝叶甲、柳毒蛾、光肩星天牛等，近年来柳蓝叶甲危害较大，严重影响柳树的生长和观赏效果[5-7]。柳蓝叶甲[Plagioderaversicolora(Laicharting)]，又名柳圆叶甲，属鞘翅目，叶甲科[8]。柳蓝叶甲是危害杨树、柳树等杨柳科树种叶部及嫩梢的主要害虫之一。它的分布范围特别广，在我国东北、河北、浙江、云南等省份以及日本、欧洲等国家均有了它的踪迹。柳蓝叶甲成虫和幼虫均取食叶片，成虫沿叶缘取食，咬食叶片成缺刻或孔洞；幼虫仅取食叶肉，叶片被危害后，残留网状叶脉，致使叶片常卷曲变褐而枯死，严重影响林木的生长。尤其对幼苗危害严重，蓝叶甲主要取食树苗主梢和枝条顶部3～5片嫩叶，大发生时可将整株叶片的叶肉吃光，使植株失去园林观赏价值，造成非常严重的经济损失[9]。目前，防治措施仍处于化学防治阶段，对环境污染较大。各个虫期和各代的重叠发生，虫口密度不断增加,在每年7月中旬至8月上中旬达到危害高峰,从而导致除虫效果不理想、容易反复、费时费力。因此，如何安全有效地预防和控制柳蓝叶甲的危害成为亟待解决的问题。南京林业大学林木遗传与生物技术实验室在野外调查中发现1种柳树——三蕊柳，在野外极少受到柳蓝叶甲的危害，表现出了较强的抗虫性，但其与抗虫相关的代谢产物尚不明确。本试验以三蕊柳、黄花柳、垂柳、白柳、蒿柳、红皮柳6种不同的柳树品种作为试验材料，并且把柳蓝叶甲作为研究对象，研究测定不同柳树对柳蓝叶甲的抗性表现，筛选出具有优良抗性的品种，并测定其主要的差异次生代谢产物，以期为培育抗虫性强且具有优良性状的柳树良种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取河北农业大学实验苗圃的6种柳树作为研究对象，分别为三蕊柳(SalixtriandraL.)、黄花柳(SalixcapreaL.)、垂柳(SalixbabylonicaL.)、白柳(SalixalbaL.)、蒿柳(Salixviminalisvar.viminalis)、红皮柳(Salixpurpurea)。

将试验材料分为非抗虫组(黄花柳、垂柳、白柳、蒿柳、红皮柳)与抗虫组(3个不同的三蕊柳无性系)作为非靶向代谢组试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1 田间调查方法 调查地点在露天自然情况下的试验苗圃中，三蕊柳、蒿柳、垂柳、红皮柳、黄花柳、白柳6种柳树均为2 a生幼苗。采用简单随机抽样法(去除具有边缘效应的苗木)，各品种随机选择30株，做好标记。分别调查每株苗木上的受害叶片数量、总叶片数量及每百片叶片上的成虫数量、幼虫数量并记录。

1.2.2 室内试验方法

1.2.2.1 室内成虫试验方法 选择培养皿进行培养，在培养皿底部放入湿润的滤纸，每个供试品种上摘取若干完整嫩叶并且测量叶面积后，用浸湿的脱脂棉包裹叶柄以防止叶片失水，再置于培养皿中，每个培养皿中接入10只柳蓝叶甲成虫，用保鲜膜封盖并在保鲜膜上扎一些小孔，每个柳树品种均设3组重复，并做好标记。在试验过程中始终保持自然光照，避免太阳光直射,每隔1 d更换新鲜叶片，将更换下来的叶片进行扫描后使用LAMINA软件分析叶片取食面积，15 d后观察柳蓝叶甲存活数量并计算存活率。

1.2.2.2 室内幼虫试验方法 采集虫卵置于室内孵化后，选择培养皿进行培养，在培养皿底部放入湿润的滤纸，每个供试品种上摘取若干完整嫩叶并且测量叶面积后，用浸湿的脱脂棉包裹叶柄以防止叶片失水，再置于培养皿中，每个培养皿中接入大小相同的20只柳蓝叶甲幼虫，用保鲜膜封盖并在保鲜膜上扎一些小孔，每个柳树品种均设3组重复，并做好标记。在试验过程中始终保持自然光照，避免太阳光直射每隔1 d更换新鲜叶片，测量叶片食用前和食用后的叶片面积，待化蛹后观察幼虫存活数量并计算存活率。

1.2.3 植物高通量非靶向代谢组 根据对6种试验材料的抗虫性鉴定结果将非靶向代谢组试验材料分为非抗虫组(黄花柳、垂柳、白柳、蒿柳、红皮柳)和抗虫组(3个不同的三蕊柳无性系)，将参试材料送至北京百迈客生物科技有限公司(Biomarker Technology， Beijing， China)进行植物高通量非靶向代谢组测定并对主要的差异次生代谢物产物进行筛选。

1.3 数据分析

用Uniscan A686扫描仪扫描叶片后，使用LAMINA软件对叶片取食面积进行测定分析；使用Excel 2010对获得的调查数据进行整理；使用SPSS 20.0对数据进行独立样本t检验以及相关性分析处理数据间差异；使用Origin 8.0对处理数据作图。采用多维分析(O)PLS-DA，单维分析和差异倍数相结合的方法筛选组间差异代谢物。使用差异代谢物数据库(http://www.hmdb.ca/；https://metlin.scripps.edu/)进行定性。

田间叶片受害情况：各品种叶片受害比值=受害叶片数量/苗木叶片总数量×100%

室内饲虫试验成虫、幼虫危害面积：扫描叶片后，使用LAMINA软件对叶片取食面积进行测定分析。

室内饲虫试验成虫、幼虫成活率：成活率=饲虫试验结束后叶甲存活数量/总的试验叶甲数量×100%。

室内饲虫试验幼虫蛹化率：蛹化率=饲虫试验结束后蛹化数量/总的试验幼虫数量×100%。

2 结果与分析

2.1 田间试验

2.1.1 田间叶片受害情况 田间自然条件下各品种的叶片受害情况见图1。

图1 田间叶片受害比值

如图1所示，三蕊柳的叶片没有出现被咬食的情况，蒿柳被咬食的叶片占总叶片的 0.50%，三蕊柳的叶片受害比值除与蒿柳的受害比值无显著差异外，均低于其他不同品种的叶片受害比值，且差异显著。其中白柳被咬食的叶片占总叶片的比值最高，约为 24.73%。将各品种按抗虫性强弱排序，顺序为三蕊柳>蒿柳>垂柳>黄花柳>红皮柳>白柳。

2.1.2 田间成虫及幼虫数量 田间自然条件下各品种每百叶的成虫及幼虫数量情况见图2。

图2 田间成虫及幼虫数量

如图2所示，每百片叶中三蕊柳上的成虫数量平均为 0 只，与其他品种的成虫数量均具有显著差异。蒿柳的平均为 2.00 只；红皮柳的平均为 4.67 只；黄花柳的平均为 4.67 只；垂柳的平均为 16.33 只；白柳的平均为 5.67 只。其中红皮柳、黄花柳、白柳的成虫数量无显著差异。垂柳的成虫数量最多，均显著高于其他品种。将各品种按抗虫性强弱排序，顺序为三蕊柳>蒿柳>红皮柳=黄花柳>白柳>垂柳。

每百片叶中三蕊柳上的幼虫数量平均为 0 只；蒿柳的幼虫数量平均为 5.00 只；红皮柳的平均为4.33 只；黄花柳的平均为 2.67 只。三蕊柳、蒿柳、红皮柳、黄花柳的幼虫数量不具有显著差异。白柳的幼虫数量最多，平均为 106.67 只，均高于其他各品种的幼虫数量，且差异显著。将各品种按抗虫性强弱排序，顺序为三蕊柳>黄花柳>红皮柳>蒿柳>垂柳>白柳。

2.2 室内饲虫试验

2.2.1 不同柳树叶片受成虫危害面积 室内饲养成虫对不同品种叶片取食面积情况见表1。

表1 不同品种柳树叶片受成虫危害面积

用6种柳树分别在室内饲养成虫15 d，每隔1 d统计叶片咬食总面积，由表 1 可知，三蕊柳在前 5 d中未出现被取食现象，除蒿柳、红皮柳以外，与其他品种的取食面积具有显著差异。柳蓝叶甲成虫从第 7 天开始取食三蕊柳，到第 13 天时，除蒿柳、红皮柳以外，三蕊柳与其他品种的取食面积具有显著差异。在第 15 天时，叶片累计被危害面积最大的是白柳，咬食总面积为 8 414.54 mm2；累计被危害面积最小的是三蕊柳，咬食总面积约为 573.91 mm2，三蕊柳的被取食面积明显低于其他各品种的被取食面积，且显著差异。将各品种按抗虫性强弱排序，顺序为三蕊柳>红皮柳>蒿柳>垂柳>黄花柳>白柳。

2.2.2 室内成虫存活情况 用不同品种柳树室内饲养成虫的存活率见图3。

室内饲养成虫15 d后的存活率如图3所示，喂食三蕊柳的成虫存活率最低，平均为6.67%，均低于喂食其他品种的存活率，且差异显著。喂食蒿柳的存活率平均为96.67%；喂食白柳的存活率平均为83.33%；喂食垂柳的存活率平均为 100.00%；喂食红皮柳的存活率平均为93.33%；喂食黄花柳的存活率平均为 90.00%。蒿柳、红皮柳、黄花柳、白柳、垂柳的成虫存活率无显著差异。将各品种按抗虫性强弱排序，顺序为三蕊柳>白柳>黄花柳>红皮柳>蒿柳>垂柳。

图3 室内成虫存活情况

2.2.3 不同品种柳树叶片受幼虫危害面积 室内饲养幼虫对不同品种叶片取食面积情况见表2。

用6种柳树分别室内饲养幼虫 11 d，每隔1 d统计叶片咬食总面积，如表 2 所示，在第 3 天时，被危害面积最小的是三蕊柳，咬食面积为 28.43 mm2，均低于其他各品种的取食面积，且差异显著。并且喂食三蕊柳的幼虫在接虫第 4 天时全部死亡，累计咬食总面积约为 36.81 mm2。将各品种按抗虫性强弱排序，顺序为三蕊柳>蒿柳>红皮柳>垂柳>黄花柳>白柳。

表2 不同品种柳树叶片受幼虫危害面积

2.2.4 室内幼虫成活情况和蛹化情况 用不同品种柳树室内饲养幼虫11 d的存活率及蛹化率见图4。

图4 室内幼虫的存活率及蛹化率

用不同品种柳树室内饲养幼虫 11 d后的存活率及蛹化率如图 3 所示，喂食三蕊柳的幼虫在接虫后的第 4 天全部死亡，幼虫存活率为 0，蛹化率为 0，均明显低于喂食其他各品种的存活率及蛹化率，且差异显著。喂食蒿柳、红皮柳、黄花柳、垂柳、白柳的各幼虫存活率均在 60%～65% 之间，无显著差异。按照幼虫存活率将各品种按抗虫性强弱排序，顺序为三蕊柳>黄花柳=垂柳=白柳>蒿柳=红皮柳。按照幼虫蛹化率将各品种按抗虫性强弱排序，顺序为三蕊柳>黄花柳>蒿柳>红皮柳>垂柳>白柳。

2.3 非抗虫组与抗虫组主要次生代谢物的分析

根据抗虫性鉴定的试验结果，三蕊柳表现出的抗虫性显著高于其他品种，所以将6种柳树分为非抗虫组(蒿柳、红皮柳、黄花柳、垂柳、白柳)和抗虫组(三蕊柳的3个无性系)进行主要次生代谢产物的定量分析，并根据定量分析筛选出主要的差异次生代谢产物见表3。

表3 非抗虫组与抗虫组主要差异代谢物

表3(续)

根据田间调查以及室内饲虫各项试验的抗虫性鉴定结果，三蕊柳表现出的抗虫性显著高于其他品种，所以将6种柳树分为非抗虫组(蒿柳、红皮柳、黄花柳、垂柳、白柳)和抗虫组(三蕊柳的3个无性系)进行主要次生代谢产物的定量分析，如表3所示，通过2组之间的对比筛选出 32 个主要差异次生代谢物。抗虫组中有 22 种次生代谢产物相对含量高于非抗虫组，其中异泽兰黄素-葡萄糖苷、异泽兰黄素、2a羟基-齐墩果酸、木犀草素-香豆酰辅酶A己糖、2-O-二没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷-β-D-吡喃葡萄糖苷、6,8-二异戊烯基香豌豆苷元6种次生代谢产物差异显著。抗虫组中有10种次生代谢产物相对含量低于非抗虫组，其中芸香甙、甲基橙皮苷2种次生代谢产物差异显著。

3 讨论与结论

本试验采用了田间直接测定法和室内试验法这2种测定方法。采用田间直接测定法测定了田间叶片受害情况、成虫以及幼虫数量这3个指标。通过调查发现，三蕊柳在田间自然条件下叶片未受到柳蓝叶甲侵害，并且苗木上未发现柳蓝叶甲成虫及幼虫。蒿柳叶片受害程度较小，导致这一结果的原因可能是蒿柳叶片背部有毛，使得柳蓝叶甲不易附着从而导致叶片受害程度轻。在成虫及幼虫数量方面，不同树种分布的成虫及幼虫数量不同，成虫分布数量由高到低依次为垂柳、白柳、红皮柳、黄花柳、蒿柳、三蕊柳，幼虫分布数量由高到低树种排序与成虫不同，依次为白柳、垂柳、黄花柳、蒿柳、红皮柳、三蕊柳，二者排序虽有差别但三蕊柳排序均为最低，三蕊柳上未发现成虫和幼虫。导致该结果的原因可能为三蕊柳叶片的形态结构与其他树种叶片有所不同或其叶片内部所含成分对柳蓝叶甲的取食产生影响[10-11]。

采用室内试验法测定了叶片受害面积、成虫存活率、幼虫存活率及蛹化率，分析结果显示，在叶片受害情况方面，室内试验与田间直接测定所得结果大致相同，个别树种的排序位置有所变动，导致该现象出现的原因可能为室内与田间环境有所差异。此外，不同柳树品种受幼虫危害面积大多为先增加后减少，而蒿柳受害面积则为先减少后增加，其原因可能为柳蓝叶甲在幼虫阶段需附着在叶片背面进行取食，蒿柳叶片背面具有绒毛导致幼虫附着困难从而饲养前期受害程度较低。在存活率方面，无论成虫还是幼虫，喂食三蕊柳的存活率均最低，成虫仅有一只成活、幼虫在喂食的第4天全部死亡，没有任何幼虫蛹化。南京林业大学的凌嘉昊通过调查野外虫害等级和室内取食率来对比簸箕柳和三蕊柳的抗虫性，结果显示三蕊柳表现出了高抗性，与本试验结果一致。他通过试验证明三蕊柳的挥发物会使柳蓝叶甲产生趋避反应，并且鉴定分析显示22 种挥发物组分在释放量方面有显著差异(P<0.05)[12]。穆丹等人通过试验证明植物的气味能够有效的调节和诱导柳蓝叶甲的行为[13]。而在本试验中发现柳蓝叶甲的幼虫对三蕊柳存在取食行为，但是在接虫后的第4天全部死亡。表明三蕊柳除挥发物会对柳蓝叶甲产生趋避反应外，次生代谢产物也可能会对柳蓝叶甲幼虫产生毒害作用，或因缺乏幼虫生长发育所必需的营养物质而导致其死亡。

根据抗虫性鉴定的试验结果，三蕊柳表现出的抗虫性显著高于其他品种，所以将6种柳树分为非抗虫组(蒿柳、红皮柳、黄花柳、垂柳、白柳)和抗虫组(三蕊柳的3个无性系)进行主要次生代谢产物的定量分析，并根据定量分析筛选出了32种主要的差异次生代谢产物。抗虫组中有22种次生代谢产物相对含量高于非抗虫组，其中异泽兰黄素-葡萄糖苷、异泽兰黄素、2a羟基-齐墩果酸、木犀草素-香豆酰辅酶A己糖、2-O-二没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷-β-D-吡喃葡萄糖苷、6,8-二异戊烯基香豌豆苷元6种次生代谢产物差异显著。Matsuda K.等人研究发现绿原酸对某些柳树甲虫具有拮抗作用[14]。Ikonen等人研究了酚类次生化合物包括水杨苷及相关糖苷和绿原酸对叶甲取食偏好的影响，研究表明叶甲拒食的柳叶中有高含量的绿原酸和水杨酸，这可能是影响叶甲取食的原因[15]。本试验也同样在三蕊柳中检测到了绿原酸和水杨酸，但其相对含量与非抗虫组相比较差异不显著，所以推测三蕊柳中起主要抗虫作用的物质可能不是绿原酸和水杨酸，或者为几种抗虫物质共同协作的结果。异泽兰黄素-葡萄糖苷、异泽兰黄素、木犀草素-香豆酰辅酶A己糖是几种黄酮类物质，黄酮类物质是植物中一类重要的次生代谢物质，可以影响昆虫的行为和代谢，使之忌避、拒食，破坏昆虫的正常代谢，严重时导致昆虫中毒甚至死亡，是对昆虫有毒的一类次生代谢物质[16]。目前已知的抗虫相关次生代谢物约有 15 000 多种，其中黄酮类的物质就占到了 1 000 多种[17]。齐墩果酸是一种五环三萜类化合物。甘甲甲等人对杀虫抑菌活性较高的外来入侵物种银胶菊的提取物进行了化学成分分析，从中分离纯化得到 14 个化合物 ，其中就含有齐墩果酸成分[18]。这些差异特定代谢物影响的机理尚待进一步深入研究与验证。

在本试验显示，三蕊柳、蒿柳、黄花柳、垂柳、红皮柳、白柳6种柳树在对柳蓝叶甲的抗性方面，白柳和黄花柳表现为高感，三蕊柳表现为高抗，三蕊柳对柳蓝叶甲的抗虫效果显著。可以通过对三蕊柳的研究培育出抗虫性强、性状优良的柳树品种，但是三蕊柳的具体抗虫机制还有待进一步研究。