辽宁义县奉国寺主殿壁画彩绘胶料的气相色谱质谱联用分析研究

黄建华，杨 璐，刘 成，陈欣楠，张志新

[1.秦始皇帝陵博物院，陕西西安 710600；2.陶质彩绘文物保护国家文物局重点科研基地(秦始皇帝陵博物院)，陕西西安 710600；3.西北大学文化遗产学院，陕西西安 710069；4.文化遗产研究与保护技术教育部重点实验室(西北大学)，陕西西安 710069；5.陕西国际商贸学院，陕西西安 712046]

0 引 言

奉国寺位于辽宁省锦州市义县县城东北部，是我国第一批全国重点文物保护单位，作为“辽代木构建筑”的重要组成部分，2012年入选世界文化遗产预备名录[1]。该寺庙始建于辽开泰九年(公元1020年)，是辽朝圣宗皇帝耶律隆绪在母亲萧太后(萧绰)的“家族封地”所建的皇家寺院[2]。其初名咸熙寺，金代改称奉国寺，因主殿供奉七尊大佛，故又名七佛寺、大佛寺。奉国寺主殿建于3 m高的台基之上，坐北朝南，面阔九间(48.2 m)，进深十架椽(25.13 m)，高21 m，建筑面积1 829 m2[2-3]。主殿正面中央7间开3门4窗，背面明间开门，其余部分用厚墙封闭。殿内供奉有七尊彩绘泥塑主佛，代表佛教中的“过去七佛”。山墙内壁绘有大幅通顶元代壁画，画面内容为须弥山座佛像。两檐柱间为一幅，共20幅，总面积达466.7 m2[4]。该壁画规模宏大、艺术水准高，是研究元代绘画艺术的珍贵实物资料，具有极高的艺术价值和历史价值。

胶料是壁画彩绘层的重要组成部分，起分散及固着颜料的作用[5]。中国古代壁画使用的胶料多为蛋白质类材料，主要包括以动物组织、皮肤或骨骼为原料熬制而成的动物胶，以及鸡蛋和奶类3种。这些材料属于天然有机高分子化合物，易随文物的老化出现降解、流失的现象，进而造成壁画彩绘层颜料的剥落，导致不可挽回的损失。因此，对包括壁画在内的彩绘文物的保护常常会涉及使用具有一定黏结力保护试剂的加固过程。但因为文物的珍贵性和不可再生性，对其进行的保护、修复应遵循“原材料、原形制、原工艺、原做法”的“四原”原则[6]，其中“原材料”是首要原则。这就要求在进行壁画保护之前对其原构成材质，包括胶料种类进行分析研究。

本研究采用气相色谱质谱联用仪(简称GC-MS)对辽宁义县奉国寺大殿壁画彩绘层文物样品进行了分析，利用GC-MS的高分离效率、高灵敏度、低检出限的特性，研究了3件文物样品胶料的氨基酸组成，在此基础上引入多元统计分析对其胶料的种类进行了判别。研究为深入了解奉国寺元代壁画制作工艺提供了重要资料，同时为该类文物保护修复材料的选择提供了指导。

1 样品和方法

1.1 实验材料及试剂

古代使用的胶料多为天然有机物，参考样品的选择以常见的古代彩绘胶料为依据，选取现代样品或依据古代传统工艺制备。用作参考样品的动物胶以新鲜猪皮为原料，在实验室按照传统工艺熬制而成；鸡蛋和牛奶均购自西安市场。采用现代样品作为胶料分析的参考样品是该类材料分析鉴别的通用做法[5]。另外，据相关前期研究表明，就本研究所采取的实验方法，不同哺乳动物的皮或骨熬制出的动物胶不存在会造成类别误判的差异[7]。

实验用以建立工作曲线的12种标准氨基酸，包括：丙氨酸(Ala)2.5 mmol/L、甘氨酸(Gly)2.5 mmol/L、缬氨酸(Val)2.5 mmol/L、亮氨酸(Leu)2.5 mmol/L、异亮氨酸(Ile)2.5 mmol/L、丝氨酸(Ser)2.5 mmol/L、脯氨酸(Pro)12.5 mmol/L、天冬氨酸(Asp)2.5 mmol/L、苯丙氨酸(Phe)2.5 mmol/L、谷氨酸(Glu)2.5 mmol/L、羟脯氨酸(Hyp)12.5 mmol/L、正亮氨酸(Nor)2.5 mmol/L(内标物)，以及衍生化试剂N-(特丁基二甲基硅)-N-甲基三氟乙酰胺(简称MTBSTFA)，均购自美国西格玛公司；萃取用氨水购自四川西陇化工有限公司，纯度为分析纯；水解用盐酸购自西安化学试剂厂，纯度为分析纯；衍生化反应用吡啶购自天津市光复精细化工研究所，纯度为色谱纯；衍生化反应用三乙胺购自天津市科密欧化学试剂有限公司，纯度为色谱纯；样品净化用Agilent OMIX C4固相萃取柱购自美国安捷伦公司。

1.2 样品处理及分析

将自制的动物胶和购买的鸡蛋、牛奶作为常用3类蛋白胶料的参考样品，分别取少量(约10 μg)置于试管中，向其中加入200 μL 2.5 mol/L的氨水，超声波辅助萃取蛋白类物质。吸取萃取液并在氮气保护下蒸干，用100 μL三氟乙酸再次溶解，并用Agilent OMIX C4柱吸附溶液中的蛋白类物质。使用甲酸-甲醇-水(0.1%∶75%∶25%，V/V)对C4柱吸附的蛋白进行洗脱。洗脱液氮气吹干后，加入6 mol/L HCl在160 ℃下微波辅助水解30 min。取出水解液后向其中加入内标物正亮氨酸。氮气保护干燥后再向其中加入10 μL含有1%TMCS的MTBSTFA、40 μL吡啶和2 μL三乙胺，于60 ℃下反应30 min[8]。最后吸取2 μL样品上机分析。

1.3 仪器及测试条件

萃取使用的KQ-50E型超声波清洗器由昆山市超声仪器有限公司生产。水解使用的Milestone ETHOS ONE型微波水解仪由意大利迈尔斯通科技有限公司生产。氨基酸组成分析使用的Agilent 7890A-5975C型气相色谱质谱联用仪由美国安捷伦科技有限公司生产，具体配置及参数如下：色谱柱DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度280 ℃；载气为He(99.999%)，流速1.5 mL/min；升温程序为初始温度100 ℃，保持2 min后以6 ℃/min的速度升温至280 ℃；模式选择为不分流；进样量2 μL；离子源EI；质谱采集模式：SIM。各氨基酸选择离子的荷质比为，丙氨酸：158，232；甘氨酸：147，218；缬氨酸：186，260；亮氨酸：200，302；异亮氨酸：200，302；丝氨酸：362，390；脯氨酸：184，286；苯丙氨酸：302，336；天冬氨酸：302，418；羟脯氨酸：314，416；谷氨酸：330，432。

数据的因子分析使用美国IBM公司出产的IBM SPSS Statistics 22软件进行。

2 结果与讨论

2.1 参考样品及文物样品的氨基酸组成

据相关记录，20世纪80年代，曾经采用1%聚乙烯醇缩丁醛对壁画进行过加固处理。聚乙烯醇缩丁醛属人工合成的有机高分子材料，其成分与古代常用于胶料的天然高分子化合物差异显著，经过适当的萃取、纯化过程不会影响样品原始胶料的分析测试结果。实验使用干净的手术刀在奉国寺大殿东壁壁画表面采集严重起翘几近剥落的彩绘层样品，并将其封装入玻璃容器中运回实验室进行胶料的氨基酸组成分析。共采集了蓝色(7.29 mg)、绿色(5.99 mg)和红色(5.05 mg)3件不同颜色的彩绘层样品，编号分别为FGS-1、FGS-2和FGS-3，见图1。文物样品的前处理过程见2.2。

图1 壁画文物样品采样部位

图2～图4是3件文物样品GC-MS分析的选择离子流图。从图中可以看出，文物样品的色谱峰型对称，不同色谱峰间的分离度较好，色谱基线平整。这说明色谱分离条件适合，以该色谱图为基础进行的积分及定量分析结果可靠。

图2 编号FGS-1样品GC-MS分析的选择离子流图

图3 编号FGS-2样品GC-MS分析的选择离子流图

图4 编号FGS-3样品GC-MS分析的选择离子流图

为了探明常见蛋白类胶料的氨基酸组成特征，为奉国寺壁画胶料种类的鉴别提供依据，实验分析了动物胶、牛奶、鸡蛋3种胶料参考样品的氨基酸组成，3种参考样品的典型选择离子流图见图5～图7。参考样品各氨基酸平均组成及3件文物样品的氨基酸组成结果见表1。

图5 动物胶参考样品GC-MS分析的选择离子流图

图6 鸡蛋参考样品GC-MS分析的选择离子流图

图7 牛奶参考样品GC-MS分析的选择离子流图

表1 参考样品及文物样品胶料的氨基酸组成均值

从表1中可以看出，作为蛋白类胶料的参考样品，动物胶、鸡蛋、牛奶的氨基酸组成各有特点。动物胶具有特殊的一种氨基酸——羟脯氨酸[9]。此外，动物胶中还含有较多的甘氨酸，其平均值为28.76%，远远超过该氨基酸在牛奶和鸡蛋中的含量。因此，含有羟脯氨酸且具有高含量的甘氨酸是动物胶氨基酸组成的明显特征。牛奶中谷氨酸的含量较高，其平均值达到24.5%，远高于其他两种胶料的该氨基酸含量。此外，牛奶中的丙氨酸含量在3种参考样品中相对较低，5.53%的平均值仅为另外两种胶料该氨基酸含量的近乎一半。鸡蛋中天冬氨酸的含量较另外2种参考胶料高，其平均值达到了16.48%。此外，鸡蛋中脯氨酸的含量较低，9.82%的平均值较另两种胶料略低。

从3件文物样品的氨基酸分析结果可以看出，编号为FGS-1和FGS-3样品的各氨基酸组成相似度较高，编号为FGS-2的样品虽个别氨基酸与另2件文物样品有所差异，但整体基本相似。从表1中可以看出，3件文物样品中均含有羟脯氨酸，但含量均较低；3件文物样品甘氨酸的含量也较高，均超过了20%。从这两种氨基酸来看，文物样品均具有动物胶的特征。但样品FGS-2的脯氨酸含量异常高，甚至超过了动物胶参考样品的平均值。同时，该样品谷氨酸的含量异常低，低于所有参考样品的平均值。此外，FGS-1和FGS-3样品的谷氨酸含量较高，高于动物胶中该氨基酸的平均含量，介于鸡蛋和牛奶之间。因此，通过个别氨基酸组成特征的数值仅能判断3件文物样品疑似具有动物胶的特点，但尚无法确认其胶料种类。造成这个问题的原因是，表1中获得的是11种氨基酸的组成信息，而通过个别氨基酸进行判断仅使用了数据的部分信息，将其他大量数据简单舍去，造成了数据的损失，自然会影响判断结果。

2.2 文物样品胶料氨基酸组成的因子分析

因子分析是一种常用的多元统计方法，是通过寻找多维数据方差最大的线性组合而进行数据的降维，从而实现数据信息量损失最小化前提下的简化处理，使多元的复杂数据得以较简单、直观的表达[10]。为了最大限度地利用文物样品胶料各氨基酸组成数据，实验将表1中3件文物样品的氨基酸组成数据与实验室参考样品的数据一起构成数据矩阵，引入因子分析法对该数据集进行降维分析，结果见表2。

表2 文物样品胶料氨基酸组成比因子分析的特征值

从表2中可以看出，文物样品胶料氨基酸组成比的因子分析中前两个因子的累积方差百分比已经达到78.49%，且第3个因子的特征值已小于1。这说明前两个因子已经能够代表原始数据11种氨基酸总信息量的78%，再增加第3个因子对因子分析的贡献不大[11-12]。因此，实验选用文物样品的前两个因子得分为坐标，与参考样品一起绘制因子得分散点图，见图8。

从图8中可以看出，3件文物样品的因子得分散点均落在了动物胶区域。这说明文物样品11种氨基酸的综合组成特征与动物胶非常相似，也印证了2.1中对个别氨基酸特征的分析判断。但文物样品的散点并不位于动物胶的中心区域，而是落在了边缘，甚至有脱离动物胶类别的趋势。为了探明造成3件文物样品散点位置偏移的原因，实验采集了本次分析的因子载荷矩阵，结果见表3。

图8 奉国寺壁画文物样品氨基酸组成的因子得分散点图

表3 奉国寺壁画文物样品因子分析的因子载荷矩阵

从表3中可以看出，造成因子散点向Factor1轴负向移动最主要的因素是甘氨酸和羟脯氨酸，而向Factor1轴正向移动最主要的因素是异亮氨酸和亮氨酸；造成因子散点向Factor2轴负向移动最主要的因素是谷氨酸和脯氨酸，而向Factor2轴正向移动最主要的因素是丙氨酸和丝氨酸。

从图8中还可以看出，3件文物样品落在动物胶边缘的主要原因是其较动物胶类别散点向Factor1轴正向的偏移。基于前文的讨论，该偏移可以由两方面因素解释。一方面，可以解释为文物样品较动物胶含有更多的异亮氨酸和亮氨酸，从而造成样品较动物胶向Factor1轴正向偏移；另一方面，可以解释为文物样品较动物胶含有较少的甘氨酸和羟脯氨酸，从而造成样品较动物胶向Factor1轴负向偏移不足。结合表1中文物样品的实测数据可以看出，文物中异亮氨酸和亮氨酸的含量高于动物胶参考样品，其平均值差别为2倍左右。此外，文物样品与动物胶参考样品的甘氨酸含量差异不大，但羟脯氨酸差距显著，平均值差别在10倍以上。由此可知，造成文物样品因子得分散点图偏移至动物胶边缘的主要原因是，文物中羟脯氨酸含量远小于参考样品，而异亮氨酸和亮氨酸的含量略高于参考样品。

羟脯氨酸是动物胶特有的一种氨基酸，是动物胶维持分子构型及胶黏性的重要氨基酸。但羟脯氨酸并不稳定，易因多种原因发生老化，转化为其他氨基酸。例如，羟脯氨酸(Hyp)的分子结构与脯氨酸类似，很容易因老化脱掉羟基而变为脯氨酸(Pro)。另外，羟脯氨酸还会在特定酶促进的氧化作用下转化为羟谷氨酸(Hyg)，进而脱羟基变为谷氨酸(Glu)[13-14]，见图9。

图9 羟脯氨酸老化降解方式

从表1中可以看出，3件文物样品的羟脯氨酸含量均远低于动物胶参考样品，这说明文物样品胶料出现了明显的老化。文物样品FGS-2主要发生了羟脯氨酸的脱羟基老化作用，其反应产物为脯氨酸，因此可以解释表1中该样品脯氨酸含量较高的现象。而文物样品FGS-1和FGS-3主要发生了羟脯氨酸的酶促氧化反应，其反应产物脱羟基后为谷氨酸，故可以解释该样品的谷氨酸含量较动物胶明显偏高的现象。酶促氧化反应一般需要在羟脯氨酸脱氢酶的作用下进行[14-15]。而微生物多会通过分泌特定的酶发生作用，故推测这2件文物样品有可能滋生过某种微生物。

3 结 论

通过对3件奉国寺壁画样品氨基酸组成的GC-MS分析，结合因子分析发现奉国寺壁画使用胶料的氨基酸组成特征与动物胶参考样品接近，即均含有Hyp且Gly含量较高。但样品FGS-2的Pro含量异常高，样品FGS-1和FGS-3的Glu含量较动物胶高。依据样品因子散点图位置和氨基酸组成特征，发现3件文物样品落在动物胶边缘的主要原因是文物中Hyp含量小于参考样品，而Leu和Ile的含量略高于参考样品。Hyp易因老化而减少。其老化方式之一是脱羟基变为Pro，FGS-2中Pro的高含量就是其Hyp脱羟基老化的结果。此外，Hyp还会在特定酶和氧气的作用下转化为羟谷氨酸，进而脱羟基变为Glu。FGS-1和FGS-3中Glu的较高含量应是发生了Hyp酶促氧化反应的结果。据此推测奉国寺壁画胶料出现了一定程度的老化。根据Hyp的酶促氧化反应一般需要羟脯氨酸脱氢酶，而微生物多会通过分泌特定的酶发生作用，推测样品FGS-1和FGS-3很有可能曾经滋生过某种微生物。