LncRNA ZFAS1 通过靶基因miR-432-5p 调控肺癌细胞增殖、侵袭和迁移的分子机制

彭胜利 肖婷 彭开利 谢碧容 （ 武汉市金银潭医院内科,湖北 武汉 43003; 武汉市蔡甸中医院）

肺癌主要包括非小细胞肺癌与小细胞肺癌两种病理类型，其中非小细胞肺癌占据较大比例，其具有较高的发病率与死亡率，目前临床治疗肺癌已取得一定进展但患者预后较差〔1〕。肺癌早期无明显临床特征，患者确诊时已处于肺癌晚期，而肿瘤细胞迁移及侵袭是导致肺癌患者高死亡率的主要原因〔2〕。由于肺癌发病机制尚未完全阐明导致临床缺乏行之有效的治疗手段，因而寻找与肺癌细胞增殖、迁移及侵袭相关的基因或蛋白均可为肺癌治疗提供新靶点。长链非编码RNA（LncRNA）异常表达可调控肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭等生物学过程，研究显示在非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤中均发现LncRNA 表达升高或降低均可影响肿瘤发生及发展进程〔3〕。LncRNA 锌指结构反义转录本（LncRNA ZFAS）1 在非小细胞肺癌患者中高表达并与患者不良预后相关，但关于其在非小细胞癌发生及发展过程中的可能作用机制尚未完全阐明〔4〕。研究表明ZFAS1 还可促进透明细胞肾细胞癌、黑色素瘤、宫颈癌等多种恶性肿瘤发生及发展〔5〕。利用生物信息学网站预测ZFAS1 可能作用于微小RNA-432-5p（miR-432-5p），研究显示miR-432-5p 在乳腺癌、肺癌及肝癌等多种恶性肿瘤中均呈低表达并可发挥抑癌作用〔6，7〕。然而，ZFAS1 是否通过靶向调控miR-432-5p 的表达影响肺癌发生及发展尚未研究，本研究主要探讨ZFAS1 对肺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响，并初步分析其是否通过调控miR-432-5p 而发挥作用，可为肺癌靶向治疗提供潜在作用靶点，有助于提高肺癌患者生存率并改善患者预后。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人肺癌细胞株H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446 均购自上海细胞生物研究所；人正常肺上皮细胞株BEAS-2B 购自上海酶研生物科技有限公司。miR-432-5p mimic、miR-432-5p 抑制剂（anti-miR-432-5p）、ZFAS1 siRNA（si-ZFAS1）及其各自阴性对照质粒均购自美国Invitrogen 公司；DMEM 培养基、胎牛血清均购自美国Gibco 公司；LipofectamineTM2000 转染试剂盒购自美国ThermoFisher 公司；Trizol、反转录试剂盒及SYBR PCR Master Mix 试剂盒均购自北京宝日医生物技术有限公司；MTT 检测试剂盒购自百奥莱博科技有限公司；兔抗人基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgGⅡ抗体、兔抗人细胞周期素（CyclinD1）单克隆抗体均购自美国Abcam公司；兔抗人CyclinE 单克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司；Transwell 小室、聚偏氟乙烯（PVDF）膜均购自美国Millipore 公司；基质胶购自美国Coring 公司；电化学发光（ECL）试剂盒购自英国Amersham公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染及分组 肺癌细胞株H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446 与正常肺上皮细胞株BEAS-2B 均常规培养于含有10%胎牛血清及双抗的DMEM 培养液中，培养条件为温度37℃、CO2体积分数5%、相对湿度95%，每隔1 d 更换1 次培养液，培养3 d 后进行传代，收集对数生长期细胞用于后续研究。ZFAS1 转染处理及分组:采用脂质体瞬时转染技术在A549 细胞中分别转染ZFAS1 siRNA及其阴性对照质粒（si-con）分别为si-ZFAS1 组、sicon 组；进一步验证ZFAS1 靶向调控miR-432-5p 的表达，在A549 细胞中分别转染pcDNA-ZFAS1、si-ZFAS1 及其各自阴性对照，分别为pcDNA-ZFAS1组、si-ZFAS1 组、pcDNA 组、si-con 组。miR-432-5p转染处理及分组:在A549 细胞中分别转染miR-432-5p mimic、miR-con，分别为miR-432-5p 组、miRcon 组。为验证ZFAS1 是否通过靶向调节miR-432-5p 表达而发挥作用，分别将si-ZFAS1 与anti-miRcon、anti-miR-432-5p 共同转染入A549 细胞，分别为si-ZFAS1+anti-miR-con 组、si-ZFAS1+anti-miR-432-5p 组。转染条件为:转染前1 d 更换为不含胎牛血清及双抗的DMEM 培养基，转染后6 h 更换为含胎牛血清及双抗的新鲜DMEM 培养基，继续放入恒温培养箱培养48 h，收集细胞用于后续实验研究。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测细胞中LncRNA ZFAS1、miR-432-5p 表达水平用Trizol 试剂提取H1299、A549、SPC-A-1、NCH446、BEAS-2B 细胞及转染后各组A549 细胞总RNA，按照反转录试剂盒说明书将RNA 反转录为cDNA 并将其用于qRT-PCR，配制反应体系为20 μl，包括2 μl cDNA，LncRNA ZFAS1、miR-432-5p 正反向引物各0.8 μl，10 μl/孔SYBR Premix Ex Taq（2×），ddH2O 6 μl/孔，ROX 0.4 μl/孔。配制体系后将其置于实时荧光定量PCR 仪进行扩增反应，反应条件为95℃2 min 循环1 次，95℃15 s，60℃60 s，72℃30 s 循环40 次。ZFAS1 以GAPDH 为内参基因，miR-432-5p 以U6 为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算ZFAS1、miR-432-5p 相对表达量。

1.2.3 Western 印迹检测CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表达 收集各组细胞，用预冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，加入100 μl 蛋白裂解液，细胞裂解物经4℃条件下12 000 r/min 转速离心10 min，吸取上清并用二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度，加入十二烷基硫酸钠（SDS）-上样缓冲液在100℃恒温水浴锅内孵育5 min，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离蛋白并转移至PVDF 膜，脱脂牛奶封闭2 h 后，分别加入CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白一抗（1 ∶500），TBST 洗涤，4℃条件下加入二抗（1 ∶5 000）孵育2 h，TBST 洗膜，用ECL 试剂盒进行显影反应，应用凝胶分析系统及Image J 图像分析软件对各条带灰度值进行定量分析。

1.2.4 荧光素酶报告基因实验 应用生物信息网站预测ZFAS1 与miR-432-5p 的结合片段，利用PCR扩增ZFAS1 基因序列上二者结合片段，将结合片段插入pMIR-REPORT 载体中构建野生型WT-ZFAS1质粒，利用基因突变技术将结合位点进行突变构建MUT-ZFAS1 突变质粒，分别用WT-ZFAS1 质粒、MUT-ZFAS1 突变质粒与miR-432-5p mimic 分别或同时对A549 细胞进行转染，参照双荧光素酶报告基因试剂盒对各组细胞荧光素酶活性进行检测，各组实验均重复3 次。

1.2.5 MTT 检测细胞增殖 收集对数生长期A549细胞，胰蛋白酶消化，调整细胞浓度为1×104个细胞/ml，以200 μl/孔接种于96 孔板，每组均设置3个复孔，分别在转染后24 h、48 h、72 h 以20 μl/孔加入MTT 溶液（浓度为5 mg/ml），置于37℃、CO2体积分数5%、相对湿度95% 的培养箱继续培养4 h，弃MTT 液，以150 μl/孔分别加入二甲基亚砜（DMSO），振荡混匀，利用酶标仪检测各孔吸光度（OD490）值。

1.2.6 Transwell 实验检测细胞迁移 用不含胎牛血清的DMEM 培养液收集“1.2.1”中各组对数生长期A549 细胞，接种于Transwell 小室的上室（细胞密度为1×105个细胞/孔），Transwell 小室的下室加入含有10%胎牛血清的DMEM 培养基（500 μl），继续培养12 h，取出Transwell 小室并用棉签刮取Transwell 小室上层细胞，甲醇（100%）固定30 min，用PBS 洗涤后结晶紫染色15 min，将其放入显微镜下随机选取5 个视野观察迁移细胞数。实验均设置3 次重复。

1.2.7 Transwell 实验检测细胞侵袭 按照细胞迁移实验收取细胞并进行相同处理，预先用无血清DMEM 培养基稀释基质胶，稀释至浓度为1 mg/μl，分别取60 μl 稀释后的基质胶置于Transwell 小室底部的上室面，恒温培养箱内培养30 min，同时将收取的细胞接种于Transwell 小室上室（1×104个细胞/孔），吸取含有10%胎牛血清的DMEM 培养基500 μl置于Transwell 小室的下室，刮出Transwell 小室上层细胞用100%甲醇固定，30 min 后用PBS 洗涤，结晶紫染色15 min，置于显微镜下观察并随机选取5 个视野计算侵袭细胞数。实验均设置3 次重复。

1.3 统计学处理 采用统计学软件SPSS22.0 进行独立样本t检验、单因素方差分析。

2 实 验

2.1 肺癌细胞株中ZFAS1 和miR-432-5p 的表达 qRT-PCR 检测结果显示（表1），与人正常肺上皮细胞株BEAS-2B 相比，人肺癌细胞株H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446 中ZFAS1 表达水平显著升高（P＜0.05），而miR-432-5p 表达水平显著降低（P＜0.05），不同肺癌细胞系A549 细胞中ZFAS1 表达水平相对较高，而miR-432-5p 表达水平相对较低，因此选取A549 细胞为后续研究细胞。

表1 肺癌细胞株中ZFAS1 和miR-432-5p 的表达(,n=3)

表1 肺癌细胞株中ZFAS1 和miR-432-5p 的表达(,n=3)

与BEAS-2B 比较:1）P＜0.05

2.2 干扰ZFAS1 表达对肺癌细胞A549 增殖的影响 与si-con组比较，si-ZFAS1组ZFAS1表达水平明显降低（P＜0.05），表明转染成功。与si-con 组比较，si-ZFAS1 组48、72 h 细胞OD 值明显降低（P＜0.05），同时Western 印迹检测结果显示si-ZFAS1 组细胞CyclinE、CyclinD1 蛋白表达显著下调（P＜0.05），见表2、图1。表明干扰ZFAS1 表达可抑制肺癌细胞A549 增殖。

表2 下调ZFAS1 表达对肺癌细胞A549 增殖的影响(,n=3)

表2 下调ZFAS1 表达对肺癌细胞A549 增殖的影响(,n=3)

图1 检测肺癌细胞A549 增殖蛋白CyclinE 和CyclinD1 的表达

2.3 干扰ZFAS1 表达对肺癌细胞A549 迁移和侵袭的影响 si-ZFAS1 组迁移及侵袭细胞数与si-con组比较明显较少（P＜0.05）。与si-con 组比较，si-ZFAS1 组A549 细胞MMP-2、MMP-9 蛋白表达显著降低（P＜0.05）。见表3、图2、图3。表明干扰ZFAS1 表达可通过降低MMP-2、MMP-9 蛋白表达进而抑制A549 细胞迁移及侵袭。

表3 下调ZFAS1 表达对肺癌细胞A549 增殖、迁移、侵袭及MMP-2、-9 蛋白表达的影响(,n=3)

表3 下调ZFAS1 表达对肺癌细胞A549 增殖、迁移、侵袭及MMP-2、-9 蛋白表达的影响(,n=3)

图2 检测肺癌细胞A549 迁移和侵袭(结晶紫染色,×200)

图3 Western 印迹肺癌细胞A549 转移蛋白的表达

2.4 ZFAS1 靶向调控miR-432-5p 的表达 用生物信息预测检测出ZFAS1 上存在miR-432-5p 结合位点，双荧光素酶报告基因实验结果（图4、表4）显示，miR-432-5p mimic 可显著降低野生型WT-ZFAS1质粒的荧光素酶活性（P＜0.05），但对突变型MUTZFAS1 质粒荧光素酶活性无明显影响（P＞0.05）。表明ZFAS1 与miR-432-5p 之间存在靶向调控关系。qRT-PCR 实验结果显示，si-con 组、si-ZFAS1 组、pcDNA 组、pcDNA-ZFAS1 组，miR-432-5p 表达分别为:1.00±0.05、7.26±0.46、1.65±0.14、0.48±0.07，si-ZFAS1 组miR-432-5p 表达显著高于si-con 组（P＜0.05），pcDNA-ZFAS1 组miR-432-5p 表达水平明显低于pcDNA 组（P＜0.05）。表明ZFAS1 可负向调控miR-432-5p 表达。

图4 ZFAS1 与miR-432-5p 互补的核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验(,n=3)

表4 双荧光素酶报告实验(,n=3)

2.5 过表达miR-432-5p 对肺癌细胞A549 增殖、迁移、侵袭的影响 miR-432-5p 组A549 细胞miR-432-5p 表达水平显著高于miR-con 组（P＜0.05），提示基因转染技术能够提高miR-432-5p 在肺癌细胞A549 细胞中的表达水平，可用于后续实验研究。与miR-con 组比较，miR-432-5p 组48 h、72 h A549 细胞OD 值、迁移及侵袭细胞数均显著降低（P＜0.05），Western 印迹实验结果显示细胞增殖、迁移及侵袭相关蛋白CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9的表达水平均显著降低（P＜0.05），见图5、表5。表明上调miR-432-5p 表达能够通过下调CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表达进而抑制肺癌细胞A549 增殖、迁移、侵袭。

图5 Western 印迹肺癌细胞A549 增殖和转移蛋白的表达

表5 上调miR-432-5p 表达对肺癌细胞A549 增殖、迁移、侵袭及CyclinE、D1 和MMP-2、-9 表达的影响(,n=3)

表5 上调miR-432-5p 表达对肺癌细胞A549 增殖、迁移、侵袭及CyclinE、D1 和MMP-2、-9 表达的影响(,n=3)

2.6 沉默ZFAS1 表达和干扰miR-432-5p 表达对肺癌细胞A549 增殖、迁移、侵袭的作用 MTT、Transwell 实验结果显示，si-ZFAS1+anti-miR-432-5p 组A549 细胞48 h、72 h OD 值、迁移及侵袭细胞数均比si-ZFAS1+anti-miR-con 组明显升高（P＜0.05），Western 印迹实验结果显示，与si-ZFAS1+anti-miRcon 组相比，si-ZFAS1+anti-miR-432-5p 组A549 细胞CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表达均显著上调（P＜0.05），见图6、表6。表明干扰miR-432-5p表达可逆转沉默ZFAS1 表达对肺癌细胞A549 增殖、迁移及侵袭的抑制作用。

表6 干扰miR-432-5p 表达逆转沉默ZFAS1 表达对肺癌细胞A549 增殖、迁移、侵袭的抑制作用及Cyclin E、D1 和MMP-2、-9 表达(,n=3)

表6 干扰miR-432-5p 表达逆转沉默ZFAS1 表达对肺癌细胞A549 增殖、迁移、侵袭的抑制作用及Cyclin E、D1 和MMP-2、-9 表达(,n=3)

与si-con 组比较:1）P＜0.05；与si-ZFAS1+anti-miR-con 组比较:2）P＜0.05

图6 Western 印迹肺癌细胞A549 增殖和转移蛋白的表达

3 讨论

肺癌靶向治疗研究取得一定效果但患者死亡率仍逐年升高，同时患者治疗后死亡率仍未得到有效改善〔8〕。因此寻找肺癌早期诊断靶点及评估患者预后的有效分子标志物对降低患者死亡率具有重要意义。近年来LncRNA 在肺癌等多种恶性肿瘤中的表达及作用引起重视，其主要可通过竞争性吸附miRNA 而降低其表达水平进而参与肿瘤细胞生物学过程〔9，10〕。

ZFAS1 是近年来新发现的LncRNA，研究显示ZFAS1 在肝细胞癌、胃癌等肿瘤细胞增殖及迁移过程中发挥重要调控作用〔11，12〕。郑茁等〔13〕研究表明ZFAS1 在鼻咽癌组织中呈高表达并与患者临床分期等临床病理特征密切相关，同时可作为早期诊断及评估患者疾病进展的重要分子标志物。李彦儒等〔14〕研究表明ZFAS1 表达异常还与心力衰竭及心肌梗死等多种心血管疾病有关，同时乳腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤组织及细胞中ZFAS1 表达均明显升高并可促进癌症发生及发展。相关研究表明ZFAS1在非小细胞肺癌患者癌组织中表达水平升高，沉默ZFAS1 表达可诱导非小细胞肺癌细胞周期阻滞并通过抑制上皮-间质转变进而抑制细胞增殖、迁移及侵袭〔15〕。本研究结果显示ZFAS1 在肺癌细胞中均呈高表达，提示ZFAS1 可能在肺癌发生及发展过程中发挥促癌作用。通过siRNA 将肺癌A549 细胞中的ZFAS1 进行下调，肿瘤细胞增殖活性明显降低，同时CyclinE、CyclinD1 蛋白表达均显著降低，而细胞周期紊乱是导致肺癌发生及发展的重要原因，CyclinE、CyclinD1 是细胞周期蛋白激酶复合物并可调控细胞周期〔16〕，说明沉默ZFAS1 可通过抑制CyclinE、CyclinD1 蛋白表达影响细胞周期进而抑制肺癌A549 细胞增殖。同时本研究发现沉默ZFAS1 表达后A549 细胞迁移及侵袭细胞数均明显减少，而MMP-2、MMP-9 蛋白表达均明显降低，MMP-2、MMP-9 是MMPs 家族成员，其可通过降解细胞外基质进而促进肿瘤细胞迁移及浸润〔17〕。说明沉默ZFAS1可通过抑制MMP-2、MMP-9 蛋白表达进而抑制肺癌细胞迁移及侵袭。提示ZFAS1 可能通过上调CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表达进而促进肺癌A549 细胞增殖、迁移及侵袭。

miR-432 在骨肉瘤细胞中低表达，上调miR-432表达能够靶向调控CX3C 趋化因子配体（CX3CL）1进而抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭〔18〕。乳腺癌患者外泌体miR-432-5p 表达水平升高可增强患者对化疗药物的敏感性〔19〕。Rihani 等〔20〕研究表明miR-432-5p 在神经母细胞瘤中呈低表达并可促进肿瘤细胞凋亡，但关于其具体作用机制尚未可知。Li 等〔21〕研究表明LncRNA625 通过靶向miR-432 调节Wnt/β-连环蛋白信号通路进而促进前列腺癌细胞的增殖和凋亡。Chen 等〔22〕研究表明miR-432 通过靶向E2F 转录因子（E2F）3 和受体酪氨酸激酶（AXL）而抑制肺腺癌细胞增殖。然而，关于miR-432-5p 在肺癌发生及发展过程中的具体作用尚未完全阐明。本研究结果显示miR-432-5p 在肺癌细胞中呈低表达，上调miR-432-5p 表达可有效抑制肺癌A549 细胞增殖、迁移及侵袭能力，同时本研究从生物信息学网站预测到miR-432-5p 与ZFAS1 有相似的结合序列位点，通过双荧光素酶报告实验检测发现miR-432-5p 可影响ZFAS1 的荧光素酶活性，说明miR-432-5p 与ZFAS1 存在相互调控关系。沉默ZFAS1 的表达后miR-432-5p 的表达上调，ZFAS1 过表达后miR-432-5p 的表达下调，提示ZFAS1 可抑制miR-432-5p 的表达水平。通过anti-miR-432-5p 转染si-ZFAS1 的A549 细胞，结果发现si-ZFAS1+antimiR-432-5p 组A549 细胞增殖、迁移、侵袭能力均得到明显提高，同时CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达均明显上调，说明ZFAS1 可靶向抑制miR-432-5p 的表达进而促进A549 细胞增殖、迁移及侵袭，抑制miR-432-5p 表达可在一定程度上增强ZFAS1 对A549 细胞增殖、迁移及侵袭的促进作用。提示沉默ZFAS1 表达可通过上调miR-432-5p 表达进而抑制肺癌细胞增殖、迁移及侵袭，有望成为肺癌靶向治疗的新型靶点。

综上所述，ZFAS1 可调控miR-432-5p 表达而影响肺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，为揭示肺癌发生的分子机制及探索新型靶标基因提供依据。但本研究存在一定局限性，关于ZFAS1 在肺癌组织中的表达变化及其与患者预后的关系均需进一步研究，同时ZFAS1 与肺癌发生及发展过程相关信号通路的作用关系仍需深入探索。