LncRNA KCNQ1OT1通过调控miR-506-3p表达调节喉鳞状细胞癌细胞的生物学行为

伊纪亮，郑娟，张萍

喉鳞状细胞癌，简称喉鳞癌，是发病率呈增长趋势的耳鼻喉科常见恶性肿瘤［1］，其治疗主要有手术、化疗和放疗，但疗效一直不佳［2］。因此，需要寻找新的治疗喉鳞癌的新方法。KCNQ1重叠转录物1（KCNQ1OT1）是一种在乳腺癌和舌癌中表达上调的长链非编码RNA（lncRNA），其分别通过靶向miR-145∕细胞周期蛋白E2（CCNE2）、miR-211-5p∕Ezrin轴促进乳腺癌和舌癌的发展进程［3-4］。此外，对奥沙利铂耐药的肝细胞癌细胞中KCNQ1OT1表达升高，敲减KCNQ1OT1可通过靶向miR-7-5p∕ATP结合盒转运体亚家族C成员1（ABCC1）轴降低肝细胞癌细胞对奥沙利铂的耐药性，KCNQ1OT1可作为改善肝细胞癌奥沙利铂耐药的分子靶点［5］。然而，KCNQ1OT1对喉鳞癌发生发展的影响还未知。生物信息学软件预测显示，KCNQ1OT1可能调控miR-506-3p的表达。miR-506是喉鳞癌细胞系中表达降低的微小RNA（miRNA），过表达miR-506可增强喉鳞癌细胞的放射敏感性［6］。本研究于2019年5月至2020年2月，首先采用RT-qPCR法检测了45例喉鳞癌患者的癌组织及癌旁组织中KCNQ1OT1和miR-506-3p表达；同时以人胚肺成纤维细胞WI-38为对照，采用RT-qPCR法检测了喉鳞癌细胞系EV-SCC-18、AMC-HN-8和HCC345中KCNQ1OT1和miR-506-3p表达；最后，以喉鳞癌细胞系HCC345为研究对象，主要探讨了KCNQ1OT1能否靶向miR-506-3p调控HCC345细胞的恶性生物学行为，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料喉鳞癌组织及癌旁组织采集自2016年5月至2018年1月于山东大学齐鲁医院桓台分院确诊并行手术治疗的45例原发喉鳞癌病人，液氮保存。男29例，女16例，年龄（56.39±8.47）岁。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》原则，病人自愿签署知情同意书。

1.2 实验细胞和试剂人胚肺成纤维细胞WI-38，上海研生实业有限公司；喉鳞癌细胞系EV-SCC-18、AMC-HN-8和HCC345，中国科学院上海细胞库；LipofectamineTM2000试剂盒、膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（FITC）∕碘化丙啶（PI）细胞凋亡试剂盒、RPMI 1640培养基和双荧光素酶活性检测试剂盒，北京索莱宝；PCR实验相关试剂盒，大连宝生物；引物序列、KCNQ1OT1小干扰RNA（si-KCNQ1OT1）及阴性序列（si-NC）、miR-506-3p模拟物（mimics）和抑制剂（anti-miR-506-3p）、模拟对照序列（miR-NC）及抑制剂阴性序列（anti-miR-NC），广州锐博生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1细胞培养WI-38、EV-SCC-18、AMC-HN-8和HCC345细胞均用含10%FBS的RPMI 1640培养基置于二氧化碳培养箱中培养。接种对数期各细胞至6孔板（1.0×105个∕孔），培养24 h，收集细胞检测细胞中KCNQ1OT1和miR-506-3p表达。

1.3.2RT-qPCR实验在获得的样本组织及细胞中加Trizol试剂，提取总RNA。将RNA反转录为cDNA后，进行PCR反应。引物序列：KCNQ1OT1正向5'-TGG TAA GTT ACA GGG CAG GG-3'，反向5'-TGA ACA TCC ATC CCC AAG CT-3'；GAPDH正 向5'-ACA TCG CTC AGA CAC CAT GG-3'，反向5'-GTA GTT GAG GTC AAT GAA GGG-3'；miR-506-3p正向5'-ACC ACC ATC AGC CAT ACT ATG T-3'，反向5'-TGT TGC ACA TTA CTC TAC TCA GA-3'；U6正向5'-CGT CGA CGT GCA TGC ACG-3'，反向5'-GCT TAA GCT AGC TAG CGC-3'。用2-ΔΔCt法计算KCNQ1OT1相对GAPDH、miR-506-3p相对U6的表达。

1.3.3细胞转染接种对数期HCC345细胞至6孔板（1.0×105个∕孔），培养24 h后，利用LipofectamineTM2000试剂盒分别转染si-KCNQ1OT1（si-KCNQ1OT1组）、（si-NC组）、或共转染si-KCNQ1OT1与anti-miR-506-3p（si-KCNQ1OT1+anti-miR-506-3p组）、si-KCNQ1OT1与anti-miR-NC（si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC组）至HCC345细胞。转染后，检测细胞中KCNQ1OT1和miR-506-3p表达，验证转染效果后，将细胞用于后续实验。

1.3.4MTT实验于96孔板中将转染后的四组细胞均培养24 h，各组细胞起始数量均为2.5×104个∕孔。培养后，加20 μL MTT（5 g∕L）将细胞孵育4 h，弃培养基，加150 μL二甲基亚砜，振荡混匀，于酶标仪490 nm处测定吸光度（A）值。

1.3.5流式细胞仪检测细胞凋亡于24孔板中将转染后的四组细胞均培养24 h，各组细胞起始数量均为5.0×104个∕孔。培养后，收集各组细胞，利用Annexin V-FITC∕PI试剂盒检测细胞凋亡。

1.3.6Transwell实验迁移实验：于Transwell上室接种各组细胞，起始数量均为5.0×104个∕孔。下室加500 μL完全培养基。培养24 h后，弃培养基，取出上室，将下室细胞进行固定和染色处理后，于显微镜下观察，计数。侵袭实验：除预先在Transwell上室铺Matrigel基质胶外，操作同迁移实验。

1.3.7KCNQ1OT1与miR-506-3p靶向关系验证由上海生工构建含miR-506-3p结合位点的KCNQ1OT1野生型荧光素酶报告载体（KCNQ1OT1-WT），同时突变结合位点，构建KCNQ1OT1突变型荧光素酶报告载体（KCNQ1OT1-MUT）。接种对数期HCC345细胞至6孔板（1.0×105个∕孔），培养24 h后，利用LipofectamineTM2000试剂盒分别共转染miR-506-3p mimics（或miR-NC）与KCNQ1OT1-WT（或KCNQ1OT1-MUT）至HCC345细胞。转染后，收集细胞并裂解。用半径10 cm离心机行离心（3 500 r∕min、10 min）处理后，取20 μL上清液，加100 μL 1×萤火虫或海肾荧光素酶反应工作液，检测萤火虫和海肾的荧光强度。细胞荧光素酶活性以萤火虫与海肾荧光强度的比值表示。

1.4 统计学方法SPSS 22.0软件分析实验数据。组织和细胞系中KCNQ1OT1和miR-506-3p的表达、各组细胞活力、凋亡率、迁移数和侵袭数及荧光素酶活性均符合正态分布，用±s表示。用独立样本t检验对两组间各实验数据进行比较。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 实验

2.1 KCNQ1OT1在喉鳞状细胞癌组织和细胞系中表达情况喉鳞状细胞癌组织中KCNQ1OT1表达量 为0.81±0.09，较 癌 旁 组 织0.27±0.08升 高（t=30.08，P＜0.05）；喉鳞状细胞癌组织中miR-506-3p表达量为0.24±0.08，较癌旁组织0.83±0.09降低（t=14.70，P＜0.05）。喉鳞状细胞癌细胞系EV-SCC-18、AMC-HN-8和HCC345中KCNQ1OT1表达量分别为2.44±0.22、2.69±0.21、3.61±0.24、较WI-38细胞1.00±0.13均升高（P＜0.05）；miR-506-3p表达分别为0.41±0.13、0.30±0.12、0.22±0.11，较WI-38细胞1.00±0.12均降低（P＜0.05）。选择KCNQ1OT1和miR-506-3p表达较WI-38细胞差异最显著的喉鳞癌细胞系HCC345进行后续实验。

2.2 敲减KCNQ1OT1对HCC345细胞增殖和凋亡的影响KCNQ1OT1在si-NC组 和si-KCNQ1OT1组HCC345细胞中的表达量分别为0.61±0.16、0.14±0.05，两组间差异有统计学意义（t=8.41，P＜0.05），说明si-KCNQ1OT1组HCC345细胞中KCNQ1OT1表达较si-NC组被敲减。si-KCNQ1OT1组HCC345细胞活力为0.41±0.06，较si-NC组细胞活力0.81±0.12降低（t=8.94，P＜0.05）。si-KCNQ1OT1组HCC345细胞凋亡率为（34.13±3.60）%，较si-NC组细胞凋亡率（3.79±2.37）%升高（t=21.12，P＜0.05）。见图1。

图1 敲减KCNQ1OT1对HCC345细胞凋亡的影响

2.3 敲减KCNQ1OT1对HCC345细胞迁移和侵袭的影响si-KCNQ1OT1组HCC345细胞迁移数低于si-NC组［（86.32±15.21）个比（162.31±20.23）个，t=9.01，P＜0.05］，侵袭数低于si-NC组［（65.23±12.05）个比（140.26±18.27）个，t=10.29，P＜0.05］。见图2。

图2 敲减KCNQ1OT1对HCC345细胞迁移和侵袭的影响

2.4 KCNQ1OT1靶向调控miR-506-3p表达生物信息学软件预测显示的KCNQ1OT1与miR-506-3p的核苷酸序列的连续结合位点见图3。共转染miR-506-3p mimics与KCNQ1OT1-WT的HCC345细胞荧光素酶活性为0.36±0.14，较共转染miR-NC与KCNQ1OT1-WT的HCC345细胞荧光素酶活性1.00±0.13降 低（t=10.05，P＜0.05）；共 转 染miR-506-3p mimics与KCNQ1OT1-MUT、miR-NC与KCNQ1OT1-MUT的HCC345细胞荧光素酶活性为1.02±0.12、1.03±0.17，两组间比较差异无统计学意义（t=0.16，P=0.87）。同时miR-506-3p在si-KCNQ1OT1组HCC345细胞中的表达量为3.34±0.21，显著高于si-NC组1.00±0.16（t=26.59，P＜0.05）。

图3 KCNQ1OT1与miR-506-3p的结合位点

2.5 敲减miR-506-3p逆转了敲减KCNQ1OT1对HCC345细胞增殖和凋亡的影响miR-506-5p在KCNQ1OT1+anti-miR-NC组和si-KCNQ1OT1+antimiR-506-5p组HCC345细胞中的表达量分别为1.00±0.09、0.25±0.06，两组间比较差异有统计学意义（t=20.80，P＜0.05），说明si-KCNQ1OT1+anti-miR-506-5p组HCC345细胞中miR-506-5p表达较KCNQ1OT1+anti-miR-NC组被敲减。si-KCNQ1OT1+anti-miR-506-5p组HCC345细胞活力为0.82±0.11，较si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC组细胞活力0.43±0.05升高（t=9.68，P＜0.05）；si-KCNQ1OT1+anti-miR-506-5p组 细 胞 凋 亡 率 为（5.32±1.85）%，较si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC组细胞凋亡率（30.25±3.48）%降低（t=18.98，P＜0.05）。见图4。

图4 敲减miR-506-3p和敲减KCNQ1OT1对HCC345细胞凋亡的影响

2.6 敲减miR-506-3p表达逆转了敲减KCNQ1OT1对HCC345细胞迁移和侵袭的影响si-KCNQ1OT1+anti-miR-506-5p组细胞迁移数高于si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC组［（158.26±19.24）个 比（88.31±15.39）个，t=8.52，P＜0.05］，侵袭数高于si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC组［（138.25±19.05）个 比（66.27±12.39）个，t=9.50，P＜0.05］。见图5。

图5 敲减miR-506-3p和敲减KCNQ1OT1对HCC345细胞迁移和侵袭的影响

3 讨论

lncRNA在真核生物中广泛存在，其可发挥miRNA分子海绵作用的表达调控miRNA靶基因的表达，共同影响肿瘤的发展进程。例如，LncRNA CASC2是肝癌组织中表达降低的lncRNA，过表达lncRNA CASC2可竞争性吸附miR-24-3p阻碍肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡［7］。既往研究显示，喉鳞癌也存在大量异常表达的lncRNA，如lncRNA CCAT2［8］、lncRNA FGD5-AS1［9］、LncRNA FEZF1-AS1［10］等lncRNA在喉鳞癌中表达升高，促进喉鳞癌的发展进程；lncRNA GAS5是喉鳞癌中表达下调的lncRNA，过表达lncRNA GAS5通过靶向调节miR-26a-5p∕UNC-51样激酶2（ULK2）轴抑制喉鳞癌细胞的恶性行为［11］。

KCNQ1OT1是近年来新发现的一种lncRNA，在多种恶性肿瘤中起调控作用。报道称，KCNQ1OT1在非小细胞肺癌组织中呈高表达，且其表达与病人TNM分期、淋巴结转移及预后密切相关，参与非小细胞肺癌发生发展［12］；敲减KCNQ1OT1可降低卵巢癌细胞的增殖和迁移能力，KCNQ1OT1是卵巢癌治疗的潜在靶点［13］；KCNQ1OT1通过调节miR-296-5p∕缺氧上调蛋白（HYOU1）轴促进宫颈癌细胞的恶性行为并促进肿瘤生长［14］；KCNQ1OT1在顺铂的结直肠癌细胞中表达上调，下调KCNQ1OT1通过靶向miR-497进而抑制B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）的表达降低结直肠癌细胞对顺铂的耐药性，KCNQ1OT1是改善结直肠癌顺铂耐药的潜在分子靶点［15］。本研究结果显示，KCNQ1OT1在喉鳞癌组织及细胞系中均表达增加，敲减KCNQ1OT1造成了喉鳞癌细胞增殖、迁移及侵袭受到抑制，而凋亡加剧，这提示敲减KCNQ1OT1有利于延缓喉鳞癌的发展进程，KCNQ1OT1也可能成为喉鳞癌治疗的新靶点。

此外，本研究首先证实了KCNQ1OT1结合并负调控miR-506-3p。miR-506-3p是前列腺癌细胞中表达降低的miRNA，上调miR-506-3p对前列腺癌细胞的恶性行为起抑制作用［16］；miR-506-3p在骨肉瘤中也发挥抑癌基因作用，其通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4和基质金属蛋白酶9的表达削弱骨肉瘤细胞的增殖和迁移行性，阻碍骨肉瘤的发展进程［17］；miR-506-3p通过靶向抑制zeste 2多梳抑制复合物2亚基增强子（EZH2）的表达阻碍结直肠癌的发展进程［18］；miR-506-3p表达的上调可阻碍肝癌细胞增殖［19］。本研究显示，喉鳞癌组织及细胞系中miR-506-3p的表达明显降低，与Tang等［6］报道结果一致；同时，本研究恢复实验数据显示，敲减miR-506-3p逆转了敲减KCNQ1OT1表达对HCC345细胞恶性行为的影响，这提示KCNQ1OT1通过靶向负调控miR-506-3p来影响喉鳞癌细胞的恶性行为。

综上所述，KCNQ1OT1在喉鳞癌组织及细胞系中KCNQ1OT1呈高表达，敲减KCNQ1OT1导致喉鳞癌细胞增殖、迁移及侵袭受到抑制，而凋亡加剧，这可能与敲减KCNQ1OT1引起细胞中miR-506-3p表达上调有关，KCNQ1OT1∕miR-506-3p轴可能为喉鳞状细胞癌的治疗提供了新靶点，但KCNQ1OT1作用的miR-506-3p的靶基因还有待进一步探究。