微孔药敏检测法检测耐多药结核病33例耐药分析

秦万，王琼，欧维正，王明栋，徐勇

耐多药结核病（MDR-TB）是指结核病病人感染的结核分枝杆菌体外细菌耐药的药敏试验（DST）证实至少同时对异烟肼和利福平耐药的结核病［1-3］。

结核耐药机制十分复杂，包括结核菌细胞壁结构与组成变化、结核菌自身的药物外排泵系统、结构药物靶编码基因发生突变［4］。我国是耐药结核病流行国家之一［5-11］。而贵州省是我国结核病高发病率、高耐药率及高负担率［12］。同时也是结核病高死亡率的地区之一。药敏检测技术的不断完善和提高，由以前几种抗结核药药敏试验到现在十几种药一次性就可以检测到药敏的耐药情况，而且7～14 d就可以出报告，这就是笔者以下重点介绍的MicroDSTTM微孔板法一次性可检测16种抗结核药药敏情况。该法在本地区的推广使用有利于MDR-TB的发现及有效药物筛选应用，为临床指导用药，减少耐药菌株的产生。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2018年1月至2019年11月贵阳市公共卫生救治中心罗氏比例法药敏试验随机筛选的MDR-TB病人各种标本罗氏培养阳性菌株33例进行16种常用抗结核药进行药敏试验，其中男25例，女8例，年龄范围18～73岁，平均年龄34.70岁。

1.2 试剂与仪器MicroDSTTM微孔板药敏检测试剂盒（培养法）由珠海银科医学工程股份有限公司提供；细菌超声分散计数仪由体必康生物有限公司提供；YK-909分枝杆菌微孔板药敏读仪、YK-96小型全自动移液平台均由珠海银科医学工程股份有限公司提供。采用一、二线抗结核药，包括四种一线药为利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇和12种二线药为利福喷汀、左氧氟沙星、阿米卡星、卷曲霉素、丙硫异烟肼、力克肺疾、莫西沙星、对氨基水杨酸、克拉霉素、利福布汀、卡拉霉素、氯法齐明。

1.3 检测方法MicroDSTTM微孔板药敏检测：取出冻干杂菌抑制剂旋开瓶盖，将无菌稀释液全部加入充分混匀后加100 μL于药敏培养基瓶内盖好盖充分混匀，用无菌吸管吸取180 μL培养液加入到A1或E1、B1和F1孔，分别作为1∕10、1∕100参照孔，再吸取200 μL培养基加入到C1、D1或G1、H1作为阴性对照孔；将培养菌株通过超声比浊1.5个麦氏单位后加100 μL于培养基中混匀，然后给每孔加200 μL含菌液的药敏培养基（除上述4孔），再吸20 μL至A1或E1孔作为1∕10参照孔，从A1至E1孔吸取20 μL至B1或F1作为1∕100参照孔，盖上盒盖，最后用透明胶布沿周边封三圈后放入自封袋密闭封口，置37℃培养7～14 d肉眼观察或通过YK-909判读，报告按照防痨规程执行。

1.4 质量控制本试剂盒对标准减毒株H37Rv（ATCC25277）的检测结果为阳性对照孔经培养后生长好，接种到药敏孔经培养后完全受抑制，鉴定为结核分枝杆菌，药敏测定为敏感；对阴性质控品的检测结果为阴性。同时，如遇个别菌活力较弱、菌液浓度调节过小或菌悬液添加过少等特殊菌株将会导致培养时间过长或不出结果，则应延长培养时间直至21 d时，阳性对照孔及药敏孔无变化，则应传代培养，重做实验。除此之外，菌悬浓度过高或菌悬液添加过多，则会出现假阳性，故操作规程务必严格按照微孔板药敏说明书进行。

2 结果

2.1 药敏检测的6种抗结核药结果MDR-TB病人菌株33例在比例法药敏检测的6种抗结核药结果对比，见表1。

表1 MDR-TB菌株33株的MicroDSTTM微孔板和罗氏比例法药敏试验结果比较

2.2 微孔板药敏法检测的33株MDR-TB其余10种二线耐药率利福喷丁78.8%（26∕33）；阿米卡星3.0%（1∕33）；卷曲霉素3.0%（1∕33）；丙硫异烟胺24.2%（8∕33）；力克肺疾33.3%（11∕33）；莫西沙星3.0%（1∕33）；对氨基水杨酸21.2（7∕33）；克拉霉素12.1%（4∕33）；利福布汀18.2（6∕33）；氯法齐明3.0%（1∕33）。

2.3 MicroDSTTM微孔板法对33株MDR-TB菌株检测的总耐药情况4种一线抗结核药总耐药数为93，耐药率为：70.5%（93∕132）；12种二线抗结核药总耐药数为81，耐药率为：20.5%（81∕396），一二线总耐药率为：33%（174∕528）。（33×4=132、33×12=396分别表示33株菌株对4种一线和12种二线抗结核药的总药数；174则表示一二线耐药的总数，即93+81=174，33×16=528则表示33株菌株对16种抗结核药的总药数）。

3 讨论

MDR-TB是造成全球结核病疫情回升的重要因素之一，也是结核病防治的难题，治疗难度大［13］。本研究对以上16种抗结核药进行药敏测试以便了解本地区MDR-TB病人的耐药情况。从以上结果可以看出，这两年MDR-TB病人的耐药情况仍然很严重，而且有的病人多种耐药还很严重，MDR-TB可进一步发展为广泛耐药结核病（XDR-TB），即结核病病人感染的Mtb经体外DST证实在耐多药的基础上至少同时对一种氟喹诺酮类和一种二线注射类抗结核药物耐药［14］。治疗的难度进一步地加大，所以笔者以MicroDSTTM微孔板法检测结核药较多的试验来进行耐多药分析，以便共同探讨和如何提高耐多药结核病人的治愈率。

罗氏培养比例法称为“金标准”法，由于检测时间较长，需要4～6周方能出结果，而且检测的药敏种数也不多，绝对浓度法也同样需要较长的检测周期，这给结核的治疗辅助作用带来了一定的难度。而MicroDSTTM微孔板MIC药敏属于表型药敏的升级换代产品，具有一定的技术先进性，故MicroDSTTM微孔板法的出现和推广对结核治疗的辅助便起到了很好的作用，与传统比例法也有很高的符合率，因而对二线抗结核药药敏的检测是可靠的，本研究结果也符合这一点。预期的效果也得到了广大临床医生的认可［15］。此法操作简单，便于自动加样和批量检测，特别是对于我们结核病人较多的专科医院，需要做药敏的病人较多，带来更为方便的一种检测方法，不仅如此，该法的检测周期也比传统的比例法或绝对浓度法短，只需7～14 d就可出检验报告，这便是MicroDSTTM微孔板法的优点。与此同时，据李静等［16］等报告，BACTEC-MGIT960法的药敏检测一线药结果与罗氏比例法药敏检测结果的对比结果比MicroDSTTM法药敏检测一线药与传统的罗氏比例法对比的结果的药物敏感性、特异性及符合率都高，而且两者之间有比较好的一致性，可见MicroDSTTM的技术已接近BACTEC-MGIT法的技术。由于此检测方法是最近几年投入使用的新技术，以前不足的地方也有了很大的提高，对利福平与异烟肼的检出结果来看，在MDR-TB病人中对异烟肼耐药检出率达97.0%（32∕33），而对利福平的耐药检出率则为93.9%（31∕33），同时其他四种抗结核药的耐药符合率也是相当高的，所以通过不断改进和进一步地完善该检测技术是值得推荐做结核药敏的好方法。

在进行抗结核治疗时，必须高度重视当地结核菌的耐药情况［17］。贵州是我国结核病高发病率、高耐药率及高负担地区之一［18］。由以上结果可以看出，本地区的结核病人耐药情况仍然十分严重，而且对一线和二线的耐药都呈现多重耐药，所以进行早期的耐药结核病检测并加以明确诊断、及时制订有效的治疗方案进行治疗，是治疗成功的主要因素［19］。本研究的对象对二线抗结核药耐药较高的是Rft及PI，耐药率依次为78.8%和33.3%，Rft耐药率高的原因可能是利福霉素类药物具有交叉耐药的特点。同时，本地区MDR-TB病人对左氧氟沙星、卷曲霉素、莫西沙星、克拉霉素、氯法齐明的耐药率比较低，可以考虑根据病人实际情况联合用药的治疗方案。

MDR-TB治疗疗程长，通常需2～3年，且效果差，死亡率高［20］。除了加强病人规范治疗和相关的结核病药敏检测外，力争在新药和新疫苗研制以及新诊断方法上取得突破［21］，就有可能破解MDR-TB病人治疗难度或遏制结核病的发病率。近年来，将克拉维酸加入含有敏感的二线药物方案中治疗耐多药∕广泛耐药肺结核，可提高痰涂片及痰培养的转阴率，对MDR-TB或XDR-TB的治疗效果较好，且罗美培南血脑屏障穿透率高，中枢神经系统不良反应发生低，在耐药的TBM（耐多药结核性脑膜炎）治疗中具有一定优势［22］。

综上所述，本地区MDR-TB病人多种耐药较严重，MicroDSTTM法药敏技术在本地区的推广使用下，对MDR-TB病人的筛选和提供治疗方案都有很大的帮助，当然该技术也存在一些不足的地方，比如在本单位开展的两年多发现，对16种抗结核药检测中克拉霉素的药敏检测不够稳定，此外就是与罗氏药敏“标准法”检测的利福平与异烟肼依然存在一定的误差，这还需要不断改进方能解决。