炎症性肠病中微小RNA的功能及临床研究进展

朱鹏 覃刚 吴莉莉

炎症性肠病(inflammatory bowel diseases，IBD)是临床上常见的慢性胃肠道炎症性疾病，流行病学资料显示在欧美发达国家地区IBD的总体发病率约为0.3%，在我国部分城市及地区的IBD发病率也呈逐年上升趋势，导致了严重的卫生及社会负担[1-3]。IBD主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD)两大类型，就病变范围而言，UC所致病变仅局限于结肠，而CD则可累及胃肠道的任何部位。IBD常见的临床症状表现为腹泻、便血、疼痛等，严重的IBD可能并发肠道穿孔及梗阻，并可能合并一些肠道外并发症且累及多个重要脏器，如强直性脊柱炎、硬化性胆管炎、结节性红斑等[4]。IBD病程通常迁延不愈，均需要长期甚至终身治疗，未得到有效控制的IBD可增加肠道恶性肿瘤的发病风险，给患者造成严重的疾病负担[5]。IBD的致病机制十分复杂，肠道的炎症性免疫应答反应在致病中发挥核心作用，其他如遗传、环境、感染等因素均可能增高IBD的发病几率[6,7]。对于IBD时机体的免疫调控机制的深入阐述一直是临床研究的热点，也是寻找IBD治疗方法的重要突破点。微小RNA(microRNA，miRNA)是仅包含21～23个核苷酸序列的单链RNA分子，miRNA本身并不具有翻译蛋白质功能，其可以直接结合到特定靶标基因的3’-非编码区(3’-untranslated regions，3’-UTRs)并抑制靶基因的转录及相应功能蛋白的翻译，从而实现对机体各种生理病理过程的调控功能[8]。特定的miRNA可能存在多个靶基因，而特定的靶基因则可被多个miRNA调控，因此miRNA与靶基因之间形成了复杂的信号调控体系。研究显示，在IBD中存在多种miRNA的表达异常，这些miRNA并通过特定的信号通路参与对肠道炎症免疫应答的调控，从而对IBD的致病及进展产生影响[9,10]。随着分子生物学检测技术的不断发展，miRNA的检测也更为便捷，而且检测成本也在逐步降低，其作为IBD疾病诊断及预后无创评估指标的价值也逐步得到研究者的重视。此外，基于细胞及动物模型的研究结果也显示出靶向特异miRNA的IBD治疗方法具有潜在的疗效，为开发更为安全有效的IBD治疗新型药物提供了重要参考。因此，本文对miRNA在IBD中的功能作用及相关临床研究最新进展进行了简要综述。

1 miRNA参与IBD的致病调节

肠道组织的炎症性免疫应答反应在IBD的致病中发挥核心作用，同时免疫炎性反应也受到多方面因素调节，不同的免疫细胞因子在其中形成复杂的调控网络及信号通路[11]。人体内miRNA分布广泛，研究显示，特异性的miRNA通过影响特定靶基因的表达参与了IBD时的机体免疫及炎症应答，从影响IBD的致病及进展过程[12]。一方面，miRNA参与了CD的致病过程，如Mohammadi等[13]研究使用mRNA芯片检测了IBD患者(n=120)外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中共计74种miRNA的表达情况，结果显示，与健康对照相比，CD患者存在10种miRNA表达升高；与UC患者相比，CD患者存在7种miRNA表达升高，其中升高最为显著的是miRNA-874-3p。既往的研究也显示，miRNA-874-3p的直接靶向调控基因是自噬相关样-16-L1(autophagy related 16-like 1，ATG16L1)基因，ATG16L1基因及其编码的自噬相关蛋白16-1能够参与多个炎症相关信号通路的调控，从而对CD的致病发挥重要的调控功能[14-16]。Zhao等[17]研究也发现，CD患者的结肠炎症组织中的miRNA-124表达程度存在异常升高，且与芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AHR)蛋白的表达水平存在负相关。基于Caco-2及HT-29细胞的功能实验显示，miRNA-124可以直接靶向结合到AHR的3-UTR，从而抑制AHR(AHR可与特异配体结合后启动肠道炎症应答通路)的表达，并对肠道炎性因子的表达进行调节，促进CD发生[17,18]。Lin等[19]研究也显示，CD患者发生炎症的肠道组织中的miRNA-143表达显著升高，而ATG2B蛋白的表达则存在显著降低。荧光素酶分析显示，miRNA-143可以靶向结合自噬相关蛋白同源体2(autophagy-related protein 2 homolog B，ATG2B)基因的3-UTR，从而抑制ATG2B表达，干扰肠道上皮细胞正常的自噬作用，增强肠道组织的局部炎症。

另一方面，针对UC的研究也发现，特异性miRNA的表达异常与UC的发生及发展存在重要的相关性。相关的研究方面，如Zhou等[20]发现，与健康对照组相比，UC及CD患者的粪便中的miRNA-16-5p表达水平均显著升高，而miRNA-21-5p仅在UC患者中升高。生物信息学软件分析显示，6个靶基因可能是miRNA-16-5p及miRNA-21-5p的下游靶基因，包括PIK3R1、GRB2、SUZ12、NTRK2、Smurf2及WWP1，而这些功能基因及其表达的功能蛋白则与肠道局部炎症及肿瘤变性存在重要相关性。Johnston等[21]基于葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulphate，DSS)诱导的UC小鼠模型的研究显示，与野生型小鼠相比，敲除miRNA-21表达的小鼠肠道16S rRNA(反映肠道菌群构成差异)表达存在显著差异，且更容易发生肠道菌群紊乱和UC，结果提示miRNA-21可能通过影响肠道菌群的定植来促进IBD的发生。功能分析显示，miRNA-21主要可以通过调节PTEN/NF-κB信号通路表达来影响肠道炎性反应及细菌的定植，从而发挥上述功能作用。而Hou等[22]也发现，DSS诱导的UC小鼠模型的miRNA-155表达显著升高，而miRNA-155的靶标基因Est-1表达则显著降低，增强miRNA-155的表达可加重UC症状及结肠炎症。同时，此项研究还发现结肠炎性组织中IL-23/17/6等Th17相关炎性细胞因子和Th17细胞均显著增多，提示了miRNA-155可能靶向抑制Est-1表达来调节IL-23/17/6相关的Th17细胞通路，从而诱导UC的发生。流行病学资料也显示，UC及CD均是肠道恶性肿瘤的风险因素，肠道长时间的慢性炎症损害与恶性肿瘤的发生存在重要联系，但是UC及CD患者进展为肠癌的相关机制目前仍未完全阐明，miRNA在其中的作用也仍不清楚，现有的研究也只是基于某个单一信号通路的表达异常来尝试解释IBD与肠道恶性肿瘤之间的关系[23]。相关的研究方面，如Wang等[24]研究发现，与正常结肠组织相比，IBD相关结肠癌小鼠模型模型及人类结肠癌组织的癌组织中miR-29a-5p表达程度显著升高，并伴随着IL-6及STAT3激活。因此，研究者认为miR-29a-5p/STAT3信号轴可能在炎症相关结肠癌的发生发展中发挥重要作用，miR-29a-5p/STAT3正反馈环路可能放大炎症作用，这一作用主要是通过抑制DNA羟甲基化酶10-11转位蛋白(TET)的表达来实现，并最终导致IBD相关结肠癌的发生。Liu等[25]基于小鼠动物模型的研究也显示，UC小鼠的肠道组织中miRNA-155的表达显著升高，同时缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)蛋白表达则显著降低，功能分析显示HIF-1α是miRNA-155的靶向调控蛋白。此外，有大量的研究也显示HIF-1α在包括结直肠癌在内的多种恶性肿瘤的发生中有着重要的调控作用，miRNA-155也通过对HIF-1α表达的影响来参与UC向结直肠癌的进展[26-28]。

上述研究结果均提示了特异的miRNA通过特定的调控途径参与了IBD的致病及进展，然而目前的研究方法仍仅能从较为片面(针对单个或数个miRNA)的角度反映miRNA在IBD中的功能，但是参与肠道炎症调控的分子通常都是以复杂的信号通路及调控网络的形式来发挥相应的作用，在这方面的研究方法及证据还较为匮乏[29]。下步还需更深入的研究和更丰富的数据来进一步阐释多类miRNA相关的信号调控网络在IBD中的作用机制。

2 miRNA用于IBD的诊断评估价值

消化道内镜及基于肠镜的肠道活组织检查仍是临床上诊断IBD的金标准，但肠镜检查属于侵入性操作，作较为复杂，且对设备、操作人员有一定要求，不便于在大规模人群中进行筛查诊断，且部分患者(如高龄、病变位置较高、腹腔感染、肠粘连等)无法耐受检查，限制了内镜在IBD诊断评估中的应用[30,31]。无创生物学指标具有检测方便且易于重复的优点，其在IBD的筛查诊断中具有特殊的临床价值。但是目前临床上并没有用于诊断及评估IBD较为可靠的无创生物学指标，学者也一直在探索准确的无创生物学指标来用于IBD的诊断、评估及预后判断。基于特异性miRNA在IBD相关炎症病变中的存在重要调控作用及表达异常，将其应用于IBD的临床诊断评估也得到了研究者的关注[32]。

一方面，大量的数据显示，特异miRNA的表达水平与IBD患者的疾病严重程度存在显著相关性，其可能作为IBD严重程度的评价指标。如Ji等[33]研究纳入117例IBD患者(UC，66例；CD，51例)，患者粪便中的特异性miRNA表达程度与IBD的严重程度存在相关性。在活动性UC患者中，miRNA-1226、miRNA-548ab、miRNA-515-5p的表达水平与溃疡性结肠炎活动指数(ulcerative colitis activity index，UCAI)呈负相关；在活动性CD患者中，miRNA-1226、miRN-548ab及miRNA-515-5p的表达水平与克罗恩病活动指数(Crohn’s disease activity index，CDAI)呈显著负相关。研究同时也发现，在给与相应的药物治疗及疾病严重程度得到改善后，上述特异性miRNA的表达可以得到升高。而Guo等[34]研究也发现，与健康对照相比，IBD患者(包含5例CD及3例UC患者)肠道炎性组织中的miRNA-7-5p表达存在显著升高，而三叶肽因子(trefoil factor 3，TFF3)表达则显著降低，且miRNA-7-5p表达程度与IBD患者肠道炎症严重程度显著正相关。同时研究者还在体外细胞模型中进行了验证，得到了相似的结果，TFF3本身是具有肠道黏膜保护作用，在IBD时TFF3的表达程度降低也加重了肠道的炎症损害。Feng等[35]研究显示，UC患者中存在显著的miRNA-146a表达降低，且重度UC患者miRNA-146a降低最为显著，且miRNA-146a降低程度与多种炎性因子如NF-κB、C-反应蛋白、IL-1β、IL-6及TNF-α表达升高存在显著相关性。此外，低miRNA-164a表达的UC患者DAI评分更高，症状严重程度及内镜下炎症评分更高。

另一方面，特异性miRNA在用于IBD的临床诊断中具有重要的价值。如Sun等[36]针对CD患者(n=66)的研究显示，与缓解期CD患者及健康对照相比，活动期CD患者血浆miRNA-125a表达显著降低，miRNA-125a用于区别诊断活动期CD与缓解期CD的曲线下面积(area under curve，AUC)为0.854，区别活动期CD与健康对照的AUC为0.780，此外，研究还发现，活动期CD患者的血浆miRNA-125a水平与反映炎症和疾病严重程度的C-反应蛋白、血沉(ESR)、CDAI、IL-17及TNF-α等呈负相关，且药物治疗3个月后获得临床缓解的活动期CD患者基线miRNA-125a水平更高。Netz等[37]探讨了血浆miRNA指标用于区别CD及UC的临床诊断价值，结果显示，CD患者的miRNA-598及miRNA-642显著高于UC患者，miRNA-598联合miRNA-642区别诊断CD及UC的AUC可达0.75。Ji等[38]研究显示，与健康对照相比，UC患者外周血中的miRNA-148表达存在显著升高，而且miRNA-148水平与患者血清C-反应蛋白及血沉存在显著的相关性。ROC分析显示，miRNA-148水平诊断UC的AUC可达0.837(P=0.008,95%CI：0.748～0.925)，诊断灵敏度可达86.9%，特异度可达91.5%。而且miRNA-148联合CRP及ESR诊断活动性UC的准确度较单项指标更高。Schonauen等[39]的研究建立了2个独立的IBD患者队列，在检测队列中，miRNA-223用于诊断活动性IBD的AUC可达0.88，用于诊断活动UC的AUC为0.93，用于诊断活动CD的AUC为0.86，同时研究者也在验证队列中对miRNA-223的诊断价值进行了证实。叶玉兰等[40]研究也发现，IBD患者肠黏膜组中的miRNA-155表达水平显著高于健康对照，且UC患者的miRNA-155表达程度高于CD患者，肠黏膜miRNA-155诊断IBD的AUC可达0.83(95%CI：0.679～0.986)，诊断特异度为0.786，灵敏度为0.684，提示miRNA-155在用于IBD诊断具有一定的价值。Chen等[41]的研究也发现，与健康对照相比，CD及UC患者血清中miRNA-146b-5p的表达分别增高2.87及2.72倍，研究者还建立了针对CD患者的内镜下炎症活动程度预测模型(仅包含miRNA-146b-5p及PLT两项指标)，模型用于预测CD患者肠道炎症程度的AUC可达0.869，高于血清CRP的AUC(0.680)。此外，也有学者关注了唾液中特异性miRNA与IBD的相关性，结果发现在CD患者的唾液中miRNA101的表达存在升高，而UC患者唾液中miRNA-21、miRNA-31及miRNA-142-3p表达存在升高，研究者认为唾液中特异性miRNA可能作为CD及UC的潜在诊断标志物[42]。但是唾液中miRNA的表达容易受到多种因素，如口腔及牙齿疾病、鼻咽部疾病、食物等影响，相较于血清学指标可能应用价值不高。

上述研究结果均提示了特异性miRNA用于IBD的临床诊断具有较好的价值，尤其是部分指标能够发挥区别诊断UC及CD的作用，为临床针对不同类型IBD的鉴别诊断提供了重要参考。此外，研究证据也显示了特异性miRNA联合多种指标(包括多种miRNA)的联合模型较单项指标在用于IBD的临床诊断时具有更高的价值。但是联合模型也存在一定的局限性，主要是可能增加检测成本，如何探索更为准确及合理成本的联合模型是下步重点研究的方向。

3 miRNA用于IBD的临床治疗

IBD的治疗仍是临床上的难点，现有的药物包括氨基水杨酸制剂、激素、免疫抑制剂等存在存在多方面(药物耐受度、不良反应等)问题，临床上一直在探索针对IBD的新型药物，从而提高针对IBD的临床疗效，改善患者的长期生活质量[43]。由于特异性miRNA在IBD的致病及发展中发挥着重要的调控作用，通过靶向调控miRNA的方法来治疗IBD也逐渐引起了研究者的重视，也取得了一定的进展[44]。然而，由于药物设计、安全性不确定等原因，目前靶向miRNA的治疗研究仍仅停留在细胞及动物模型层面，距离临床验证及实际应用还有一定的距离，还有很多技术及伦理问题需要进行探讨研究。

在miRNA用于UC治疗的相关研究方面，如Fang等[45]在来源于UC患者及UC模型小鼠的结肠炎症组织中均观察到miRNA-31-3p(靶标基因为RhoA基因)的表达升高，同时，通过靶向抑制剂来抑制NCM460细胞系中miRNA-31-3p的表达可以增高TNF-α、CXCL10及CCL2的mRNA的表达程度，而增高miRNA-31-3p的表达可以缓解DSS诱导的结肠炎症。研究提示，负载miRNA-31-3p的药物微粒可能作为IBD治疗的潜在方法。Wu等[46]研究也发现，miRNA-206在UC中有重要的促炎症作用，其主要通过抑制A4AR基因的表达并激活NF-κb信号来发挥促炎症作用，在UC小鼠模型中，针对miRNA-206拮抗剂可增高A4AR的表达，并减弱TNF-α、IL-8、IL-1β等促炎性因子合成，从而缓解UC的炎性反应。He等[47]也发现，与健康对照相比，UC患者的炎性组织及外周PBMC中的miRNA-301a表达存在显著升高，miRNA-301a表达增高可显著抑制其靶标基因SNIP1的表达，并促进TH17细胞分化，从而加重UC时的肠道炎症。研究者也在模型小鼠中证实，使用miRNA-301a抑制剂可通过上述途径减弱炎症相关Th17细胞的分化，从而缓解IBD时的肠道炎性反应，提示了miRNA-301a可能作为IBD治疗的潜在靶点。如基于HT29细胞的体外试验也显示，增高miRNA-141表达可以降低CXCL5、MMP-2及MMP-9等，从而抑制磷脂酰肌醇三激酶-丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶(PI3K/AKT)信号通路(经典的细胞自噬调控信号通路)表达，从而抑制UC的结肠炎症活动[48]。

在miRNA用于CD的治疗相关研究方面，如Shi等[49]基于三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的CD小鼠模型的研究显示，模型动物肠道炎症组织中的miRNA-31表达存在显著降低，且与IL-25表达存在显著负相关，而且通过增强miRNA-31的表达可通过抑制IL-25来影响Th1/Th17细胞相关信号通路功能从而缓解CD动物的结肠炎症，提示了miRNA-31/IL-25可能作为CD治疗的潜在靶点。IL-25也被称为IL-17E，其本身属于IL-17超家族，其能够调节2型免疫应答反应，在结肠上皮的炎症应答中发挥重要的调节作用，功能实验也显示IL-25是miRNA-31的直接调控靶标蛋白[50]。Zhao等[51]的研究显示，在TNBS诱导的CD小鼠模型肠道炎症组织中，miRNA-130a-3p表达存在显著升高，进一步的功能实验显示，miRNA-130a-3p靶向抑制ATG16L1的表达，从而促进NF-Κb相关信号通路的激活来促进CD的发生。而且研究者还发现，使用特异性miRNA-130a-3p抑制剂能够诱导巨噬细胞相关自噬作用，从而抑制NLRP3炎症小体活性，从而改善结肠炎情况，这也为开发新的CD靶向药物提供了重要参考。

上述研究均显示，靶向特定miRNA的治疗方法可能有助于缓解IBD相关的肠道炎症，作为IBD治疗的可能靶点来筛选新型的药物。但是这些研究均只是停留细胞或动物模型层面，距离开发高效安全的可用于人体的药物还有很大距离。虽然这些靶向药物(或分子)的安全性仍属未知，但是基于靶向特性miRNA的新型药物仍具有十分巨大的潜能，值得进一步更深入的研究。

综上所述，特异性miRNA在IBD的致病中发挥着十分重要的调控作用，而且作为无创生物学标志物，miRNA可以作为IBD的临床诊断、评估及预后指标。此外，靶向特异miRNA的治疗为开发针对IBD的临床新型药物也提供可能。下步的研究方向仍需要更深入的探讨miRNA在IBD致病中的调控机制，并通过开发基于特异miRNA的靶向药物来改进IBD的临床治疗，从而使更多的患者从中获益。