生物活性肽制备、鉴定及其生物活性研究进展

王耀冉，陈明杰，李治平，钟静诗，董沁，赵妍*

1. 上海市农业科学院食用菌研究所（上海 201403）；2. 上海海洋大学（上海 201306）

生物活性肽（BPs）是在人体健康和代谢功能中起重要作用，具有积极影响的特异性蛋白质片段，通常含有2～20个氨基酸残基[1]。目前，“BIOPEP”数据库已有4 032个生物活性肽的报道[2]，包括抗菌、抗氧化、抗癌、抗衰老、抗炎和降血压等生物活性。BIOPEP数据库中与人类健康相关的生物活性肽的数量如图1所示。

图1 BIOPEP数据库中与人类健康相关的生物活性肽的数量

从食品中提取的生物活性肽，因其对人类疾病的预防和控制作用更为安全和温和，而受到越来越多研究人员的关注。在生物活性肽的制备过程中，其分离纯化技术一直是研究的热点。良好生物活性的多肽，常采用超滤进行粗分离、色谱进行细分离，结合光谱、质谱等方法对肽进行表征，采用固相法合成目标多肽，再通过体内和体外试验进行活性验证和稳定性分析。对于具有良好活性的肽，根据活性特点开发其在功能性食品、营养保健品、医药制剂和化妆品等行业的应用。

文章对生物活性肽的制备方法及序列的鉴定进行了综述，阐述了生物活性肽的抗菌、抗氧化、抗癌、抗衰老、抗炎和降血压等功能，以期为生物活性肽的应用提供参考。

1 生物活性肽的制备

生物活性肽的制备是以蛋白质为原料，利用酶解、微生物发酵等方法从蛋白质中释放多肽。

1.1 酶解法

酶解法具有操作简单、容易控制且能在较短时间获得更一致水解产物的优点。

酶解使用的蛋白酶类型非常重要，如表1所示，不同酶具有不同的酶切位点，会产生不同的肽段，影响水解产物的生物活性。Dong等[3]使用六种蛋白酶对灰树花进行酶解制备肽，结果发现胰蛋白酶在pH 7.5、温度45 ℃水解1.5 h所得水解产物具有最高的抗氧化活性。Pino等[4]使用枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶的酶组合水解沙丁鱼蛋白，获得具有抗糖尿病活性的多肽。

表1 常用的一些商品蛋白酶

用于酶解蛋白的酶种类很多，对于单一酶或复合酶酶解的最佳效果目前没有达成共识，因此筛选合适的酶是获得高活性生物活性肽的关键。

1.2 微生物发酵法

微生物在发酵过程会产生许多蛋白酶作用于底物蛋白，是生产生物活性肽的有效途径。如Ano等[5]从发酵乳制品中筛选出的二肽WY抑制了小胶质细胞对脂多糖的活化，从而改善了认知能力的下降。微生物虽然具有来源广、繁殖快、蛋白酶产量高等优点，但微生物生产的酶活力不稳定将会导致获得的肽品种及数量的重现性不稳定。

多种方法协同处理有利于生物活性肽的制备。如：刘子毅等[6]发现超高压协同碱性蛋白酶制备玉米黄粉ACE抑制肽，不仅提高了ACE抑制率，且酶解时间缩短到15 min以内；Gammoh等[7]通过对骆驼奶乳清蛋白和酪蛋白进行超声处理和使用德式乳杆菌进行发酵，结果发现超声处理和发酵后骆驼奶乳清蛋白和酪蛋白的抗氧化活性和ACE抑制活性均增加。

2 生物活性肽的分离纯化及鉴定

2.1 生物活性肽的分离纯化

分离纯化是分析多肽结构和活性之间关系的重要步骤，选择合适的分离技术能够更加准确地富集生物活性肽。

Wang等[8]在木瓜蛋白酶的最佳酶解条件下酶解路氏双髻鲨的醇溶性蛋白，使用超滤（UF）、离子交换层析（IEC）、凝胶过滤层析（GFC）和反相高效液相色谱（RP-HPLC）对酶解产物进行分离纯化，得到的两个肽WDR和PYFNK均表现出良好的抗氧化活性。Wang等[9]通过Sephadex G-15凝胶层析、高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）等色谱技术纯化大西洋三文鱼副产物的胃蛋白酶酶解物，所得肽TPEVHIAVDKF具有抗过敏活性。借助多种色谱相结合选择最优的方法，能更好地对粗多肽进行分离纯化，从而得到高活性、高纯度的肽。

2.2 生物活性肽的鉴定

对肽的结构进行鉴定能够更好地理解结构和功能之间的关系。质谱（MS）可以准确测定多肽的分子量和氨基酸序列[10]；圆二色谱（CD）可获得多肽的二级结构组成[11]；红外光谱（IR）可测定蛋白质二级结构组成最敏感的光谱区酰胺I，进而分析多肽中可能存在的基团[12]；核磁共振（NMR）通常与红外光谱联用，鉴定多肽中存在的特殊的官能团[13]。

Jia等[14]从文蛤中分离出的抗氧化肽MmP 4（LSDRLEETGGASS）、MmP 11（KEGCREPETEKGHR）、MmP19（IVTNWDDMEK）能促进转录因子DAF-16的核转位，增强抗氧化防御系统中sod-3、ctl-1和ctl-2等基因的表达，提高线虫对百草枯的抗性，圆二色谱显示MmP 4主要为β折叠片，MmP 11和MmP 19主要为无规卷曲。莫加利等[15]通过超纳滤、RP-HPLC从风干武昌鱼中分离纯化出纯度均一的鲜味肽，使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）、氨基酸自动分析仪、傅里叶变换红外光谱（FTIR）测定鲜味肽的分子质量、氨基酸组成和二级结构。

多种方法联用可以在多肽的结构解析中达到相互补充的效果，从而能更加准确地解析结构和活性之间的关系。

3 肽的生物活性

3.1 抗菌活性

肽序列通常由5～50个氨基酸残基组成，高疏水性和净正电荷的特性为抗病原体奠定了基础。Noore等[16]发现阳离子抗菌肽LL-37相较于抗生素对细胞内和细胞外的金黄色葡萄球菌的杀伤力更迅速且有效。Yu等[17]研究发现胰蛋白酶水解获得较小尺寸的肽，有利于与微生物膜的相互作用，进而改变微生物膜的渗透性，从而导致其分解。

随着细菌耐药性的增强，人们对新型抗菌肽的需求量日益增加。加大对于天然抗菌肽的探索，在生物医药研发及应用方面具有重要的意义。

3.2 抗氧化活性

在人体中过量的自由基攻击生物分子引起氧化损伤会导致各种疾病的产生，如癌症、衰老、动脉粥样硬化等[1]。多项研究表明抗氧化剂在相对较低的浓度下，能够抑制或延缓细胞的氧化损伤，对人体健康具有重要的作用。

肽结构和氨基酸序列影响其抗氧化性能，多肽两端或侧链含有芳香族和疏水性氨基酸，可以增强其抗氧化能力。Guo等[18]发现在C端含有Tyr残基的二肽（LY、RY和YY）具有较强的羟自由基、过氧化物自由基清除活性。通过用9种蛋白酶水解23种成熟亚麻籽蛋白，结果发现菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶相较于胰蛋白酶和胃蛋白酶水解亚麻籽蛋白所得的肽具有更高的抗氧化能力，且芳香族、疏水性和带负电的氨基酸频繁地出现在这些肽中[19]。

尽管蛋白质来源的生物活性肽具有减少活性氧导致的氧化应激的作用，但其不良反应、安全性和致敏性有待进一步研究以确定其治疗用途。

3.3 抗癌活性

癌症是全球发病率和死亡率高的主要原因之一，是由体内细胞的异常生长和增殖产生的[20]。一些抗癌的化学药物存在较大副作用，对正常的细胞造成损害[21]，从食物蛋白等自然资源中发现新的抗癌药可以为癌症的预防和治疗提供更好的选择。

从孔鳐蛋白酶水解物中分离出的六肽FIMGPY通过诱导细胞凋亡抑制Hela细胞的增殖，具有高剂量依赖性抗增殖活性[21]。Wang等[22]通过实验室细菌酶协同作用和油菜粕固态发酵的组合方法制备油菜籽肽RSP-4-3-3，在体外可显著改变HepG2细胞的形态学特征并引起细胞凋亡，从而抑制HepG2细胞的增殖。Umayaparvathi等[20]发现牡蛎肽LANAK通过抑制癌细胞的生长、增加DNA损伤和凋亡，来启动HT-29结肠癌细胞的死亡。由上可知，生物活性肽具有作为抗增殖剂和抗癌剂的强大潜力。

3.4 抗衰老活性

皮肤衰老是由内在因素和外在因素共同作用导致的。这些因素对皮肤作用的后果是细胞外基质过度降解，抗菌功能丧失，氧化应激与炎症反应增加。

体外研究表明，生物活性肽具有抑制衰老相关酶活性的作用。例如：用胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶共同作用水解螺旋藻获得的螺旋藻生物活性肽，对胶原蛋白酶活性抑制达92.5%[23]；源自南沙绿藻的蛋白质水解物，具有较高的抗弹性蛋白酶和抗透明质酸酶活性[24]；鱼的副产物生产胶原蛋白经水解后产生的＜1 kDa的组分，具有抑制酪氨酸酶和胶原蛋白酶的抗衰老活性[25]。类似地，Hong等[26]报道小于3 kDa的胶原蛋白肽的组分具有更高的酪氨酸酶活性抑制作用。生物活性肽是具有较高安全性且对皮肤有保护作用的功能成分，它们可以有益地影响皮肤中的多种生理途径。

3.5 抗炎活性

炎症是机体对多种炎症因子的防御反应，是许多疾病中常见的病理过程。抑制炎症细胞因子的合成和活性是炎症治疗的关键。生物活性肽显示出抑制或减少炎症标志物，以及通过调节转录因子产生抗炎效果。极大螺旋藻酶解产物LDAVNR、MMLDF能显著抑制肥大细胞中组胺的释放以及内皮细胞中IL-8的产生[27]。Cheng等[28]从金枪鱼烹饪汁中纯化的肽PRRTRMMNGGR具有抑制LPS诱导细胞分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ的作用。Gao等[29]从鲟鱼胃蛋白酶水解产物中纯化所得的级分F2对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞的抗炎作用归因于抑制MAPK和NF-κB信号通路、促炎性细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的释放和IκBα的磷酸化。

3.6 降血压

高血压是指动脉内持续的血压升高，是引起心血管疾病的主要危害因素。ACE能催化血管紧张素I转化为血管紧张素Ⅱ，且能使缓激肽失活，因此抑制ACE的活性对于防治高血压意义重大。ACE抑制肽阻断了血管紧张素II的合成，并抑制激肽酶Ⅱ的减少和缓激肽的破坏[30]。

ACE的抑制作用与肽的序列和分子量关系密切，ACE抑制肽的序列由疏水性氨基酸和脂肪族氨基酸组成[31]。Escudero等[32]从猪肉的体外消化物中鉴定出的三种新肽RPR、KAPVA、PTPVP具有抗高血压活性；Lau等[10]发现泡囊侧耳纯化肽AHEPVK可能与ACE活性部位结合，阻止其与底物结合，而对ACE表现出竞争性抑制；Geng等[33]从松茸子实体的水提取物中提纯的ACE抑制肽，其IC50值为0.40 μmol/L，低于所有乳清和酪蛋白衍生的ACE抑制肽的IC50值。

虽然动物和体外证据指出了食物来源的生物活性肽具有降血压作用的潜在机制，但是仍需进一步进行体内试验进行验证。

表2 生物活性肽及其功能

4 结语

生物活性肽作为食物蛋白水解的产物，具有多种生理活性，可作为功能性食品、保健品、膳食补充剂和药品的基本成分。目前采用酶解法、微生物发酵法等制备生物活性肽，但对活性肽的体内作用机制研究较少。2019年5月，在西班牙巴伦西亚举行的第二届国际生物活性肽研讨会的“热门话题”之一就是生物活性肽的作用机制。与此同时，肽的化学结构与其活性作用机制密切相关，因此对肽结构的深入研究有助于探索其作用机制。近年来，将生物信息学和经典方法相结合进行科学研究，如以计算机为工具，预测生物活性肽的前体蛋白、活性、分析生物活性肽的物化性质以及活性机制等，应用结构生物活性建模，如定量结构活性关系建模、分子对接试验等方法，可以对生物活性肽进行更为透彻的研究。