提取方法对玉木耳多糖结构及抗氧化活性的影响

王楠，张闪闪，陈玥彤，刘婷婷*

1. 吉林农业大学食品科学与工程学院（长春 130118）；2. 农业农村部食用菌加工技术集成科研基地（长春 130118）；3. 吉林省粮食精深加工与高效利用工程研究中心（长春 130118）；4. 吉林省粮食精深加工与副产物高效利用技术创新重点实验室（长春 130118）

玉木耳（Auricularia corneaEhrenb.），属木耳科木耳属，是毛木耳的白色变异菌株[1]，是一种营养价值较高的食药用菌。玉木耳多糖（Auricularia corneaEhrenb. polysaccharide，ACEP）含量约为6.56%，是玉木耳中主要活性成分。相关研究表明，玉木耳多糖具有抗氧化[2]、抗炎[3]、抗疲劳[4]等多种功能。

近年来关于玉木耳多糖的研究主要集中于提取方法及其生物活性等方面的研究。罗敬文等[2]利用水提醇沉法得到玉木耳多糖并测定其抗氧化活性及其对大肠杆菌的抑制能力；王秀秀[3]采用蜗牛酶提取法提取玉木耳多糖并证明其具有抗氧化、抗炎症等生物活性；金凤石[4]利用高压蒸煮法提取玉木耳多糖并研究其抗疲劳特性。由于玉木耳等食用菌自身的复杂结构，多糖被包裹于细胞壁内，为了提高多糖的提取率以及生物活性，相关研究学者常采用一些辅助方法，如超声波、高温高压、酶解等。范金波等[5]利用超声波辅助酶法提取黑木耳多糖并确定其最佳提取工艺。黄秀锦[6]利用酶法提取银耳多糖溶液，并分析了其抗氧化活性。黄晓德等[7]采用高温高压法提取银耳子实多糖，确定其最佳提取工艺下的提取率为36.5%。

加压热水浸提是在氮气的保护下，以高压蒸煮法为基础，利用高温和压力对物料的细胞壁结构进行破坏，提取高生物活性物质的方法[8]。酶解-加压热水浸提协同提取法是一种酶解联合加压热水浸提的生物活性物质的技术，具备用时短、耗能少、制备的玉木耳多糖生物活性高等优点。现在关于不同提取方法对玉木耳多糖提取率及其生物活性的影响的系统性报道还相对较少。

试验以玉木耳为原料，采用5种方法（ACE-R、ACE-J、ACE-M、ACE-MJ、ACE-MR）提取玉木耳多糖，研究不同提取方法对玉木耳多糖提取率、理化特性、结构特征及体外抗氧化活性的影响，筛选出制备抗氧化活性高的玉木耳多糖的最适宜提取方法，以期为玉木耳的功能性开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉木耳，市售；纤维素酶，美国Sigma公司；DPPH试剂，美国Sigma公司；邻苯三酚等其他试剂均为分析纯，国药集团化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

UWave-1000高压反应釜（上海新仪微波科技公司）；IR RESTIGE-21傅里叶变换红外光谱仪（日本岛津公司）；SSE-550扫描电子显微镜（日本岛津公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 玉木耳粗多糖的提取

1.3.1.1 ACE-R提取玉木耳多糖

准确称取10 g粒径0.106 mm玉木耳粉，按料液比1∶100（g/mL）加入蒸馏水，于90 ℃提取6 h，重复提取2次，离心（4 000 r/min，20 min），上清液采用Sevag法脱蛋白，浓缩后于4 ℃醇沉12 h（95%乙醇溶液），离心（4 000 r/min，20 min），沉淀冻干即为玉木耳粗多糖ACEP-1。

1.3.1.2 ACE-M提取玉木耳多糖

准确称取10 g粒径0.106 mm玉木耳粉，按料液比1∶100（g/mL）加入蒸馏水，加入1.0%的纤维素酶，pH 5.0，于50 ℃提取120 min，于100 ℃灭活15 min，后续操作同1.3.1.1，即为玉木耳粗多糖ACEP-2。

1.3.1.3 ACE-J提取玉木耳多糖

准确称取10 g粒径0.106 mm玉木耳粉，按料液比1∶100（g/mL）加入蒸馏水，在高压反应釜内提取，压力为2.0 MPa，温度为100 ℃，时间为55 min，后续操作同1.3.1.1，即为玉木耳粗多糖ACEP-3。

1.3.1.4 ACE-MR提取玉木耳多糖

准确称取10 g粒径0.106 mm玉木耳粉，按料液比1∶100（g/mL）加入蒸馏水，加入1.0%的纤维素酶，pH 5.0，于50 ℃提取120 min，于100 ℃灭活15 min，将酶解后的样液在90 ℃下提取6 h，后续操作同1.3.1.1，即为玉木耳粗多糖ACEP-4。

1.3.1.5 ACE-MJ提取玉木耳多糖

准确称取10 g粒径0.106 mm玉木耳粉，按料液比1∶100（g/mL）加入蒸馏水，加入1.0%的纤维素酶，pH 5.0，于50 ℃提取120 min，于100 ℃灭活15 min，将酶解后的样液放入高压反应釜内提取，温度为100℃，压力为2.0 MPa，反应时间为55 min，后续操作同1.3.1.1，即为玉木耳粗多糖ACEP-5。

1.3.2 玉木耳多糖提取率的测定

参考张闪闪等[8]的方法，将玉木耳多糖提取液稀释到一定质量浓度，用苯酚-硫酸法测其多糖含量，玉木耳多糖提取率按式（1）计算。

式中：m1为根据标准曲线计算的玉木耳多糖质量，mg；n为稀释倍数；v1为玉木耳多糖提取液的体积，mL；m为玉木耳粉的质量，mg；v2为吸取稀释玉木耳多糖提取液的体积，mL。

1.3.3 玉木耳多糖理化特性的测定

1.3.3.1 溶解性的测定

称取0.1 g玉木耳多糖，分别加入50 mL的蒸馏水、乙醇、丙酮和无水乙醚等溶剂，观察其溶解性。

1.3.3.2 碘-碘化钾试验

参照董英等[9]的方法，检测多糖中是否含有淀粉。

1.3.3.3 三氯化铁试验

参照刘婷婷等[10]的方法，取1 mL的玉木耳多糖溶液（1 mg/mL）与三氯化铁混匀，观察颜色变化。

1.3.3.4 斐林试剂试验

参照陈慧[11]的方法，将1 mL玉木耳多糖溶液（10 mg/mL）与4 mL斐林试剂混匀，沸水浴反应15 min，观察有无红色沉淀出现。

1.3.3.5 硫酸-咔唑试验

参照刘莹等[12]的方法，检测多糖中是否存在糖醛酸。

1.3.4 玉木耳多糖红外光谱的测定

参照杨嘉丹等[13]的方法，准确称取2 mg玉木耳多糖，加入200 mg烘干至恒重的KBr，研磨压片，在4 000～400 cm-1范围进行红外扫描。

1.3.5 玉木耳残渣的扫描电镜观察

使用扫描电镜观察玉木耳粉和ACE-R、ACE-J、ACE-M、ACE-MJ、ACE-MR玉木耳残渣的微观结构。

1.3.6 玉木耳多糖体外抗氧性化测定

将5种多糖配制成不同质量浓度（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mg/mL）的多糖样液进行DPPH、超氧阴离子和羟基自由基清除能力的测定，分别参考文献[14]、[8]和[15]进行。

1.4 数据统计分析

采用Origin 8.5软件绘制图形，Excel 2016、Spss 8.0.6软件进行分析作图。试验均重复3次，数据以平均值±标准差（±s）表示误差。

2 结果与分析

2.1 提取方法对玉木耳多糖提取率的影响

如表1所示，多糖提取率由高到低依次为ACE-MJ＞ACE-MR＞ACE-J＞ACE-R＞ACE-M，其中ACE-MJ的多糖提取率最高，为34.95%±0.07%。原因可能是先用纤维素酶对玉木耳的细胞壁结构进行酶解破坏，然后在氮气保护下，利用高温和压力进一步加快物料细胞壁破坏，加速溶剂渗透与多糖扩散速度，增大多糖的提取率。

表1 提取方法对玉木耳多糖提取率的影响

2.2 提取方法对玉木耳多糖理化特性的影响

由表2可知，5种方法提取的玉木耳多糖均溶于蒸馏水，不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有机溶剂；碘-碘化钾反应、三氯化铁反应和斐林试剂反应均呈阴性，表明多糖中无淀粉、酚类物质和还原糖存在；硫酸-咔唑反应呈阳性，表明多糖中有糖醛酸存在。

表2 提取方法对玉木耳多糖理化特性的影响

2.3 玉木耳多糖红外光谱分析

由图1可知，5种方法提取的玉木耳多糖均具有糖类化合物特征峰，且具有相似的红外特征峰，表明不同提取方法对玉木耳多糖的初级结构无明显影响。其中3 380 cm-1处的吸收峰是O—H伸缩振动引起的，分子间氢键的存在使其峰形变宽[16]。在2 920 cm-1处的吸收峰是亚甲基（—CH2—）中的C—H伸缩与变角振动引起的，是多糖物质的特征吸收峰[17]。在1 620 cm-1和1 420 cm-1处的振动峰是羰基C＝O和C—O伸缩振动引起的，说明多糖中含有糖醛酸[18]。在1 380 cm-1处的吸收峰是甲基C—H的弯曲振动峰，与C—H的伸缩振动构成了糖环的特征吸收[19]。在1 250 cm-1处是O—H键伸缩振动，在1 080 cm-1处是C—O伸缩振动，该物质中含有吡喃环。在895 cm-1处的吸收峰说明多糖含有β-糖苷键。

图1 玉木耳多糖的红外光谱图

2.4 提取方法对玉木耳粉末微观结构的影响

由图2（A）观察到，玉木耳粉表面平滑，偶有因机械破碎产生的小颗粒堆积在其平滑表面，表观形貌较完整。由图2（B）观察到，ACE-M玉木耳残渣表面受到轻微破坏，出现一些细小裂隙，这是因为纤维素酶对其细胞壁结构造成了破坏，进而促使多糖溶出。由图2（C）观察到，ACE-R玉木耳残渣表面的裂隙增多且加深，有碎片堆积在表面，这是因为ACE-R促进溶剂缓慢进入细胞壁，改变细胞壁内外渗透压，促使多糖溶出。由图2（D）观察到，ACE-J玉木耳残渣表面受破坏程度较前两者更严重，表面凹凸不平，裂纹深且密，碎片增多，可能是因为在氮气的保护下，高压高温使细胞壁大幅度破裂，增加了多糖提取率。由图2（E）观察到，ACE-MR玉木耳残渣表面遭到破坏程度更大，裂纹横贯表面，裂隙深且明显，这是因为先利用纤维素酶对其细胞壁进行酶解后，再通过ACE-M协同提取，加速了溶剂渗透和多糖的溶出。由图2（F）观察到，ACE-MJ玉木耳残渣表面受破坏程度最为严重，从内层到外层翻卷起大量的碎片，裂隙又深又密，内部区域暴露更多，形成更为复杂的空间结构，这是因为在氮气的保护下，酶法结合高温高压处理，细胞壁被严重破坏。综上表明不同提取方法对玉木耳残渣表观结构破坏程度不一样，致使其多糖提取率也有明显差异。

图2 玉木耳粉及5种方法提取后的玉木耳残渣的扫描电镜图

2.5 提取方法对玉木耳多糖抗氧化性的影响

玉木耳多糖的体外抗氧化活性结果如图3所示。5种方法提取的玉木耳多糖均具有较好的抗氧化活性。由图3（a）可知，在0.5～3.0 mg/mL之间，DPPH自由基清除能力随多糖浓度升高而增强，呈正相关关系；在2.0 mg/mL时，ACEP-1、ACEP-2、ACEP-4和ACEP-5对DPPH自由基的清除能力均已达到50%以上；其中ACEP-2的清除能力与VC最为接近。由图3（b）可知，在0.5～2.5 mg/mL之间，羟基自由基清除率随多糖浓度的升高而显著增强，呈剂量依赖关系；但质量浓度大于2.5 mg/mL时，其清除率随浓度的增大趋势渐趋平缓。当质量浓度为3.0 mg/mL时，ACEP-2清除羟基自由基的能力最强，清除率为72.14%。由图3（c）可知，在0.5～1.5 mg/mL之间，随多糖浓度的增加其自由基清除能力迅速增强；在1.5～3.0 mg/mL之间，自由基清除能力逐渐趋于平稳。在0.5～3.0 mg/mL之间，ACEP-2和ACEP-5清除超氧阴离子自由基的能力相近；在3.0 mg/mL时，清除率能力由高到低依次为ACEP-2（70.16%）＞ACEP-5（68.21%）＞ACEP-4（65.13%）＞ACEP-1（64.87%）＞ACEP-3（56.65%）。

图3 提取方法对玉木耳多糖体外抗氧化的影响

3 结论

试验主要利用ACE-R、ACE-M、ACE-J、ACEMR和ACE-MJ 5种方法制备玉木耳多糖，其中ACEMJ提取率最高，为34.95%±0.07%。理化结果表明，5种玉木耳多糖均溶于蒸馏水，不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有机溶剂；碘-碘化钾、三氯化铁和斐林试剂反应均呈阴性，表明玉木耳多糖中不存在淀粉、酚类物质及还原糖类；硫酸-咔唑反应呈阳性，表明玉木耳多糖中有糖醛酸存在。傅里叶红外光谱显示，5种方法提取的玉木耳多糖均具有相似的糖类化合物红外特征峰。扫描电镜分析显示，不同提取方法对玉木耳残渣粉末表观结构破坏程度不一样，其玉木耳多糖提取率也有明显差异，其中ACE-MJ对玉木耳粉末表观破坏最为严重，其多糖提取率也最高。体外抗氧化结果表明，5种方法提取的玉木耳多糖对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基均有一定的清除作用，其中ACEP-2的抗氧化能力最强，ACEP-5次之，二者均能够较好地保留多糖的生物活性，综合考虑提取率、抗氧化活性，ACE-MJ为最优方法。该研究可为玉木耳多糖高效制备及其作为功能因子的研究提供一定的理论基础。