牛乳主要过敏原的拉曼光谱检测分析

李靖，李梦银，陈守慧，魏新林*，王元凤*

1. 上海交通大学农业与生物学院（上海 201100）；2. 上海师范大学生命科学学院（上海 200030）

牛奶是婴幼儿最先摄入的一种食物，而牛奶过敏在年龄较小的儿童（小于3岁）中出现概率达8%，被确认为幼儿期最常见的食物过敏的原因之一[1]；而美国的一项研究显示，其约占所有食物所引起过敏反应的20%[2]。在8种主要食物过敏中，牛奶过敏是仅次于花生和坚果的第三大常见过敏。牛奶过敏通常由免疫球蛋白（IgE）介导，牛乳过敏者在食用牛乳及乳制品后会出现各种各样的功能障碍或组织损伤，严重时会造成过敏性休克[3]。目前认为酪蛋白（casein，CN）、α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）和β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）是牛乳主要过敏原[4-6]。用于检测牛乳过敏原的方法主要包括免疫分析技术[7]、液相色谱技术、生物质谱技术[8]、实时PCR、电喷雾电离质谱等，这些方法虽然灵敏度高，但需要较长的检测时间或者昂贵的仪器设备。

拉曼光谱是一种研究分子振动的光谱分析技术。拉曼效应是指当一束光照射到介质时，部分光会向四面八方散射，而其中少部分散射光既改变传播方向，又改变频率，此种光现象被称为拉曼效应[9]。无论是气体、液体或是固体，拉曼效应普遍存在于一切分子中，且每一种物质（分子）都有自己的拉曼光谱特性，因此可将拉曼特征峰用以物质的表征[10]。拉曼光谱由于受水分子干扰小，非常适合生物样品，被用于快速、无损、方便地检测多种食品成分。

试验通过对CN、α-LA、β-LG进行拉曼光谱扫描以获得其特征峰，并对巴氏杀菌乳、风味发酵乳、干酪等多种乳制品的实际样品进行拉曼光谱扫描，根据其所含的对应CN、α-LA、β-LG的特征峰可以实现乳制品中过敏原的定性检测。由此，可以根据实际样品的拉曼光谱特征峰判断其过敏原信息，达到定性分析的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

α-LA（纯度95%，美国Sigma公司）；β-LG（纯度97%，美国Sigma公司）；CN（纯度91%，国药集团化学试剂有限公司）；巴氏杀菌乳、乳饮品、调味奶浆、炼乳、奶油、干酪和再制干酪（上海沃尔玛超市）。

1.2 仪器与设备

LD-UPW-10超纯水机（上海砾鼎水处理设备有限公司）；Velocity 14R冷冻离心机（上海天美科学仪器有限公司）；VM-01U涡旋混合仪（美国精骐有限公司）；SB-5200DTD超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；色散型共聚焦拉曼光谱仪（德国Bruker Optics公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 试验样品的制备

CN、α-LA、β-LG的标准品呈粉末状直接用于检测。

巴氏杀菌乳、乳饮品：以12 000 r/min离心15 min去除上清（脂肪），下层样品斡旋振荡5 min。

调味奶浆、炼乳、奶油：用水稀释适量倍数后，以12 000 r/min离心15 min去除上清（脂肪），下层样品斡旋振荡5min。

干酪、再制干酪：用60 ℃热水超声溶解，用水稀释适量倍数后，以12 000 r/min离心15 min去除上清（脂肪），下层样品斡旋振荡5 min。

1.3.2 拉曼光谱采集条件

将CN、α-LA、β-LG粉末样品、巴氏杀菌乳等样品置于载玻片上，其中固体粉末状样品需压平，置于显微镜载物台上，采集拉曼信号。拉曼光谱采集参数设置为：激发波长632.8 nm，激光功率5 mW，曝光时间2 s，每个谱图的扫描时间8 s，累积次数3次，扫描范围45～4 500 cm-1。

1.3.3 图谱预处理与数据分析

拉曼光谱的扫描需要经过基线校正和平滑降噪2个预处理步骤。用Origin Pro 8.5软件进行曲线绘制和平滑处理。

2 结果与讨论

2.1 标准品光谱数据处理

对3种蛋白标品进行拉曼检测，并进行去噪和平滑处理，见图1。

图1 CN（a）、α-LA（b）、β-LG（c）的拉曼光谱图

2.2 标准品光谱分析

拉曼光谱中的酰胺Ⅲ区（1 230～1 340 cm-1）是蛋白质构象灵敏度的谱带区，该区域能够提供相关主链构象的振动信息[11]，包括C—N振动、N—H面内弯曲振动等，也能够反映蛋白质二级结构的信息，如α-螺旋结构、芳香环的振动等；酰胺Ⅰ区（1 600～1 700 cm-1）对解析蛋白质的二级结构提供更加丰富的信息，不仅含有C＝O伸缩振动的信息，还包含多肽链内部的C—N振动等的信息[12]。

CN、α-LA、β-LG光谱图经过预处理后，在757～3 060 cm-1处信号丰富。CN在994，1 337，1 451，1 679，2 934和3 060 cm-1处信号丰富，存在1 679 cm-1的酰胺Ⅰ（β-折叠结构）和位于1 230～1 340 cm-1的酰胺Ⅲ蛋白质骨架信号，基本表现在1 337 cm-1处；α-LA的拉曼光谱特征峰为757，883，1 002，1 129，1 333，1 446，1 558，1 663，2 931和3 061 cm-1，存在1 663 cm-1的酰胺Ⅰ区（α-螺旋结构含量高）和位于1 230～1 340 cm-1的酰胺Ⅲ区蛋白质骨架信号，基本表现在1 333 cm-1处，酰胺Ⅱ振动发生在1 510～1 570 cm-1区域，表现在1 558 cm-1处，属于面内氮氢变形与碳氮拉伸的异相组合，信号弱；β-LG在1 007，1 240，1 301，1 444，1 552，1 667，2 931和3 060 cm-1处拉曼峰强度大，存在1 667 cm-1的酰胺Ⅰ（β-折叠结构含量高）和位于1 230～1 340 cm-1的酰胺Ⅲ蛋白质骨架信号，基本表现在1 240 cm-1和1 301 cm-1处，酰胺Ⅱ区振动表现在1 552 cm-1处。

根据常见化学基团的拉曼峰归属及其他相关报道的对照分析，可对CN、α-LA、β-LG的光谱特征峰进行峰位归属[13-16]。

2.3 实际样品中牛乳过敏原的定性检测

选取液体乳、炼乳、乳脂肪、干酪等4类乳制品进行拉曼检测，对照表1中所示的过敏原特征峰判断实际样品中是否含有牛乳主要过敏原CN、α-LA、β-LG。

表1 乳及乳制品主要过敏原拉曼特征峰归属

选择液体乳中的巴氏杀菌乳、乳饮品、调味奶浆等进行拉曼光谱扫描（见图2）。巴氏杀菌乳的拉曼光谱中谱峰为1 046，1 180，1 311，1 415和1 571 cm-1，经对照验证后发现巴氏杀菌乳内含β-LG；乳饮品的拉曼谱峰为1 047，1 182，1 310，1 416和1 571 cm-1，经匹配后发现乳饮品内含β-LG；调味奶浆的拉曼特征峰为1 046，1 178，1 309，1 415和1 571 cm-1，经对照分析后发现调味奶浆内含β-LG。

图2 巴氏杀菌乳（a）、乳饮品（b）、调味奶浆（c）拉曼光谱图

炼乳的光谱峰为894，1 527，1 655，1 761，2 885和3 892 cm-1，经分析后发现炼乳内含α-LA。炼乳拉曼光谱图见图3。

图3 炼乳拉曼光谱图

乳脂肪是以乳脂肪为原料浓缩而成的乳制品，主要包括稀奶油、黄油等。奶油的拉曼光谱图见图4。特征峰为572，1 083，1 302，1 435，2 851，3 649和3 969 cm-1，经对照分析后发现其中含β-LG。

图4 奶油拉曼光谱图

干酪是指在生鲜牛奶加工过程中加入凝乳酶，使奶中的蛋白质凝固，经过发酵、压榨等过程所制得的奶制品。奶酪和再制干酪拉曼光谱情况见图5。奶酪的拉曼光谱特征峰为1 441，2 852，3 656，3 837和3 971 cm-1，经匹配后发现奶酪内含β-LG；再制干酪在1 652，2 934和3 969 cm-1处表现出较强的拉曼信号，经对照、匹配后发现再制干酪内含α-LA。

图5 奶酪（a）和再制干酪（b）拉曼光谱图

3 讨论

由测得的拉曼光谱来看，不同物质有着不同的拉曼光谱，这是因为它们具有不同的化学组成，而各组成元素之间又有着不同的振动模式，如对称伸缩振动、非对称伸缩振动、弯曲振动等，这些都造成拉曼信号相对于激发源频率的移动，于是产生拉曼光谱图中丰富的特征振动峰。

试验通过色散型共聚焦拉曼光谱仪对牛乳主要过敏CN、α-LA和β-LG进行拉曼光谱检测，分析3种蛋白的特征峰及其分子结构归属，在757～3 060 cm-1处拉曼信号丰富。酪蛋白的拉曼特征峰为994，1 337，1 451，1 679，2 934和3 060 cm-1，α-LA的拉曼特征峰为757，883，1 002，1 129，1 333，1 446，1 558，1 663，2 931和3 061 cm-1，β-LG的拉曼特征峰为1 007，1 240，1 301，1 444，1 552，1 667，2 931和3 060 cm-1。经拉曼扫描及对照分析，巴氏杀菌乳、乳饮品、调味奶浆、奶油、奶酪内含β-LG，炼乳、再制干酪内含α-LA。

拉曼光谱在过敏原检测方面可从2个方面发展：一是汇总更多的过敏原基本图谱信息，建立小型的过敏原拉曼光谱数据库，并有望建立数字化的光谱数据库系统，为实际样品提供过敏原数据支撑，实现过敏原的定性检测；二是由于拉曼技术直接用于检测蛋白信号会较弱，因此可以利用表面增强拉曼光谱技术提高检测灵敏度，以实现高灵敏的定量检测。