响应面法优化桑椹白藜芦醇的提取工艺及动力学研究

文海朝，李学静，王汗鑫，王云鹤，赵敏琦，李红姣*

河北农业大学林学院，河北省林木种质资源与森林保护重点实验室（保定 071000）

白藜芦醇是植物次生代谢产生的一种多酚类化合物。研究发现，白藜芦醇具有抗氧化[1]、抗癌[2]、保护神经[3]等多种药用保健功效。提取白藜芦醇物质的主要天然材料有虎杖[4]、爬山虎根皮[5]、转基因莱茵衣藻[6]、花生根[7]、桑椹[8-10]等，但这些天然资源受地域、季节等自然条件的限制，其开发利用程度有限，不能完全满足市场需求[11]。

桑椹是桑树（Morus albaL.）的成熟果穗，具有抗氧化、保肝、消炎、降血糖[12]、增强免疫力等功能。有研究表明，桑椹中白藜芦醇含量不低于甚至高于葡萄、花生、蓝莓等植物[13]。葛亮等[9]研究优化了利用超声波提取桑椹中白藜芦醇的提取应用工艺；陈琼玲等[10]利用响应面法优化桑椹中白藜芦醇的提取工艺；曹喜涛等[8]采用响应面法优化白藜芦醇的提取工艺条件。上述研究通过不同提取方法，确定白藜芦醇提取工艺的参数，但并未涉及提取过程中的动力学研究，无法得出白藜芦醇提取过程中的关键控制步骤。

试验以桑椹冻干粉为材料，基于单因素试验和响应面试验，分析影响MR提取得率的因素，并优化MR的提取工艺；深入分析MR提取过程中的各种影响因素及提取动力学，得出MR提取过程中的关键控制步骤，为开展白藜芦醇的规模化提取及拓宽白藜芦醇植物资源的利用提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜成熟的桑椹品种“孟简”，采自河北省定州市，采摘时桑椹成熟度一致，大小均匀，无腐败变质，采后冷冻干燥后粉碎过筛（50目，孔径0.297 mm），在-80 ℃条件下储藏备用。

1.2 标准曲线的制定

精确称取适量白藜芦醇标准品，用60%乙醇水溶液溶解并调整至最终质量浓度分别为0.005，0.010，0.015，0.020和0.025 mg/mL，以60%乙醇水溶液为空白对照，分别测定A305nm。以白藜芦醇质量浓度为横坐标，以A305nm为纵坐标，做标准曲线，并进行回归分析。

1.3 MR提取工艺优化

1.3.1 MR提取的单因素试验

准确称取0.2 g桑椹冻干粉于10 mL离心管中，按表1进行水浴加热，水浴结束后过滤，7 000 r/min下离心10 min，取0.5 mL上清液，测定A305nm。以MR的提取得率作为响应值，分析乙醇体积分数、液料比、提取时间、提取温度等因素对MR提取得率的影响。

表1 MR提取单因素试验的因素与水平设计

1.3.2 试验设计

以单因素试验结果为依据，根据中心组合设计原理，采用响应面法，设计四因素三水平的试验方案，优化MR提取工艺。

1.4 提取动力学试验

准确称取0.2 g（精确至±0.001 g）桑椹冻干粉置于离心管中，加入4 mL的60%乙醇溶液混合作提取液，液料比20∶1 g/mL，均匀混合后放置于恒温水浴锅内，提取温度分别设置为40，45，50，55 和60℃，于提取0.5，1.0，1.5，2.0、2.5，3.0，3.5，4.0，4.5和5.0 h时分别取样，离心后取上清液在305 nm波长下测定吸光度，根据标准曲线计算MR提取得率，试验重复3次。

1.5 数据处理方法和分析方法

2 结果与分析

2.1 不同单因素对MR提取得率的影响

2.1.1 温度对MR提取得率的影响

由图1可看出：随着提取温度升高，MR提取得率随之增大，温度50 ℃时，MR提取得率达到最大；继续升高温度，MR提取得率减小。由此可知，温度达到50 ℃时MR提取效果最好。

图1 提取温度对MR提取得率的影响

2.1.2 乙醇体积分数对MR提取得率的影响

如图2所示：随着乙醇体积分数增大，MR提取得率会随之增大，乙醇体积分数达到50%时，MR提取得率最大；乙醇体积分数大于50%并继续增大时，MR提取得率会随之减小。由此可知，乙醇体积分数50%时MR提取效果最好。

图2 乙醇体积分数对MR提取得率的影响

2.1.3 液料比对MR提取得率的影响

由图3可以看出：随着液料比增加，MR提取得率呈逐步增大趋势，液料比20∶1 mL/g时，MR提取得率达到最大；液料比大于20∶1 mL/g时，MR提取得率会随之减小。由此可知，液料比20∶1 mL/g时提取效果可达到最好。

图3 液料比对MR提取得率的影响

2.1.4 提取时间对MR提取得率的影响

由图4可知：随着提取时间延长，MR提取得率呈略微增大趋势，提取1.5 h时，MR提取得率可达最大；提取时间继续后移，MR提取得率会逐渐减小。在1.0和1.5 h条件下，提取MR得率变化不显著，选择提取时间1.0 h为后续试验条件。

图4 提取时间对MR提取得率的影响

2.2 响应面结果分析

2.2.1 响应面分析因素水平的选取

以中心组合设计原理为理论依据，以MR提取得率（mg/g）为响应值，用Design-Expert软件设计四因素三水平的响应面试验。试验因素及水平编码表见表2。

表2 响应面试验的因素与水平

2.2.2 响应面试验结果

试验次数共计29次，通过响应面回归分析，试验结果见表3，方差分析结果见表4。由表4可知，建立的回归模型p＜0.01，表现为极显著，而模型失拟项p=0.097＞0.05，表现为不显著，综合回归模型和失拟项显著性结果可知回归模型拟合较好，此模型可用于预测各项因素对MR提取得率的影响。运用Design-Expert软件对数据进行回归分析和拟合后，得出以下函数，可以表示各因素对MR提取得率的影响：

表3 响应面试验结果

表4 回归方程方差分析表

Y=0.69-0.018A+0.025B+0.069C-7.156E-003D-0.020AB+0.012AC+3.320E-003AD+0.014BC-7.846E-004BD+0.021CD+7.431E-003A2+0.027B2-7.638E-003C2+0.021D2

根据模型进行分析并回归后，得出MR最优提取工条件：提取温度41.44 ℃，乙醇体积分数59.99%，液料比25.00∶1 mL/g，提取时间1.5 h。MR提取得率预测值最高可以达到0.877 mg/g。经验证，在此试验条件下，MR提取得率为0.841 mg/g，与预测值无显著差异。

2.3 提取动力学

2.3.1 动力学试验结果

根据1.4的方法分别在不同温度条件下考察MR随时间变化的提取情况，结果如图5所示。随着温度升高，MR提取得率增大，提取达到平衡的持续时间缩短。提取的初始阶段，随着温度不断升高和时间延长，MR提取得率会迅速增大，随后，提取得率增加逐渐缓慢，直至达到平衡稳定状态。出现此现象的原因是提取过程的初始阶段，乙醇溶液逐渐深入到桑椹冻干粉颗粒内部，MR被快速溶解，桑椹冻干粉颗粒内外溶液产生高浓度差，促使MR快速浸出，提取得率较高，随着提取时间的逐渐延长，MR浸出量逐渐增加，溶液中MR含量逐渐增大，溶液浓度差逐渐减小，提取速率逐渐减小，直至趋于平衡。总体上看，MR提取过程在0～2 h内变化较快，该阶段为提取动力学区域。

图5 不同温度下MR提取得率与时间的关系

2.3.2 桑椹中白藜芦醇液固相浸提的动力学模型拟合

根据试验数据分析，0～2 h为白藜芦醇的提取动力学阶段，将该阶段试验数据分别代入固-液相浸提的不同的动力学方程中，结果如表5所示。

表5 固液相浸提的动力学模型拟合试验数据所得参数

试验数据与内扩散模型的动力学方程拟合效果最佳，表明MR的提取过程为内扩散控制的动力学模型，提取速度决定于内扩散的速度，因此减小桑椹冻干粉颗粒的直径或升高温度，有助于提高桑椹冻干粉中MR提取速率。

2.3.3 MR提取的表观活化能

MR提取过程中的速率常数与提取温度的关系一般遵循Arrhenius公式[14]，两边同时取自然对数得式（1）。

lnk=lnA-Ea/RT（1）式中：Ea为表观活化能，kJ/mol；A为指前因子或频率因子；k为速率常数；R为气体常数，8.314 J/mol·K；T为温度，K。据此求得表观活化能Ea=22.125 kJ/mol。一般内扩散控制的动力学反应前后颗粒直径不变，且表观活化能在8～30 kJ/mol的范围内。试验结果与文献报道[10, 15-16]的植物有效成分提取的表观活化能相吻合，符合内扩散的活化能范围。

3 结论

在单因素试验基础上，采用响应面法对MR的提取工艺进行改进，得出最优提取条件：提取温度41.44℃，乙醇体积分数59.99%，液料比25.00∶1 mL/g，提取时间1.5 h，MR提取得率预测值最高可达0.877 mg/g。MR提取过程与固液相提动力学模型中内扩散模型拟合效果最佳，因此MR的提取过程为内扩散控制的动力学模型。