油莎草总生物碱提取工艺优化及定量分析

敬思群*，张俊艳，刘根梅，布威佐合热·艾科热木，涂亦娴

1. 韶关学院英东食品学院（韶关 512005）；2. 新疆大学生命科学与技术学院（乌鲁木齐 830046）

油莎草（Cyperus esculentusL.），为莎草科（Cyperaceae）、莎草属（Cyper）多年生草本植物，又称油莎豆、人参果、地下核桃[1-2]。油莎草全株包括地上茎叶、块茎和根须3个部分。《新华本草纲要》里记载，油莎豆块茎性辛、甘、温，有疏肝行气、健脾和健胃功效，主治肝郁气滞所致的胁痛、胸闷；脾胃气滞所致的脘腹胀满、胃痛纳呆、脾虚食少、食积停滞、消化不良等症。瞿萍梅等[2]研究报道，油莎草具有天然药物的一些功能。因此对油莎草活性成分的研究有助于油莎草资源药用价值的进一步开发。

前期研究发现油莎草块茎中含有生物碱、萜类、蒽醌、甾类及三萜类等活性成分[3]。生物碱是自然界中广泛存在的一类含氮碱性有机化合物，大量研究表明生物碱具有抗炎、抗癌、抗肿瘤、神经保护等作用[4-10]。国内外关于油莎草块茎的油脂及淀粉研究已有报道[11-17]，但有关油莎草块茎的生物碱研究未见报道。对生物碱进行定量分析的方法主要有酸性染料比色法、碱量法、高效液相色谱法、气相色谱法等。其中：紫外分光光度法对仪器要求较低，选择性较差；高效液相色谱法分离机制明确，分离效果好，选择性好，能同时测定几种双酯型生物碱的含量，但所采用的流动相碱性较强，易破坏色谱柱固定相，对中成药制剂测定时，需较多的提取分离步骤[18]；pH示差法多用于测定花色苷含量[19]，其原理根据朗伯-比尔定律，在不同pH条件下，花色苷吸光度的差值和溶液中花色素含量呈比例关系。该方法能有效避免花色素吸光度不稳定而影响结果准确度的问题[20-22]。采用pH示差法测定生物碱含量的研究尚未见诸报道。

以油莎草地下块茎为研究对象，通过单因素试验及正交优化试验优化油莎草块茎总生物碱提取工艺，并采用pH示差法测定总生物碱含量，以期为油莎草块茎生物碱产业化提取提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油莎草块茎（实验室种植）；无水乙醇、石油醚、盐酸、氨水、丙酮、氯仿、普罗托品（C20H19NO5）、氯化钾、冰乙酸、乙酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠（国产分析纯）；去离子水（实验室自制）。

1.2 仪器与设备

KQ-C玻璃仪器气流烘干器（巩仪市英欲予华仪器厂）；HH-2数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；FW-100高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器厂）；旋转蒸发器RE-52AA（上海亚荣生化仪器厂）；AL104分析天平（德国Mettler-Toledo Group）；Anke TDL-5-A离心机、725型分光光度计（上海安亭科学仪器厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

将采摘的新鲜油莎草块茎清洗干净，于55 ℃烘箱中烘干，粉碎，过0.425 mm（40目）筛后作为提取原料。称取适量干燥油莎草块茎粉末，装入滤纸筒后放入索氏抽提器中后加入适量石油醚浸泡30 min后于恒温水浴55 ℃回流8 h脱脂，取出滤纸筒放入通风橱，挥干石油醚，收集脱脂后的油莎草块茎粉末备用。

1.3.2 总生物碱提取工艺流程

参考文献方法[23-24]。油莎草块茎→乙醇回流提取→减压浓缩→浸膏→2%的盐酸溶解、过滤→酸水溶液→氨水调pH至碱性→氯仿萃取→浓缩、干燥→生物碱。

1.3.3 单因素试验

参考文献[25-27]，以总生物碱的提取得率为指标，考察乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度对总生物碱得率的影响。

1.3.3.1 乙醇体积分数对总生物碱提取得率的影响

准确称取30 g预处理后的油莎草块茎，分别用40%，50%，60%，70%，80%和90%乙醇，按料液比1∶13 g/mL在80 ℃条件下按1.3.2提取工艺流程提取2.5 h，计算总生物碱的提取得率，确定最适乙醇体积分数。

1.3.3.2 料液比对总生物碱提取得率的影响

准确称取30 g预处理后的油莎草块茎，以70%乙醇作为提取溶剂，分别按料液比1∶5，1∶7，1∶10，1∶13和1∶15 g/mL在80 ℃条件下，按照1.3.2工艺流程提取2.5 h，计算总生物碱的提取得率，确定最适料液比。

1.3.3.3 提取时间对总生物碱提取得率的影响

准确称取30 g预处理后的油莎草块茎，以70%乙醇作为提取溶剂，按料液比1∶13 g/mL配制，静置过夜，在80 ℃条件下，按照1.3.2工艺流程分别提取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 h，计算总生物碱的提取得率，确定最适提取时间。

1.3.3.4 提取温度对总生物碱提取得率的影响

准确称取30 g预处理后的油莎草块茎，以70%乙醇作为提取溶剂，按料液比1∶13 g/mL分别在40，50，60，70，80和90 ℃条件下按照1.3.2的工艺流程提取2.5 h，计算总生物碱提取得率，确定最适提取温度。

1.3.4 油莎草块茎中总生物碱的提取得率计算

式中：m1为氯仿萃取物质量，mg；m0为样品质量，g（脱脂后干粉质量）。

1.3.5 pH示差法测定总生物碱含量

1.3.5.1 缓冲液的配制

pH 0.5～2.0缓冲溶液（0.1 mol/L柠檬酸溶液逐滴加入盐酸，pH计校正配制）；pH 1.0缓冲溶液（V0.2mol/LKCl∶V0.2mol/LHCl=25∶67）；pH 4.5缓冲溶液（V0.2mol/LNaAc·3H2O∶V0.2mol/LHAc=1∶1）；pH 3.0～6.0的缓冲溶液（0.1 mol/L柠檬酸和0.1 mol/L柠檬酸钠，pH计校正配制）。

1.3.5.2 生物碱吸收光谱的测定

参考龙沛霞等[28]的方法。分别用70%乙醇溶液和pH 3.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制少量生物碱溶液，用紫外可见分光光度计在200～800 nm的范围内扫描生物碱溶液，得到生物碱吸收光谱图。

1.3.5.3 pH的确定

参考王少波等[29]的方法。为使pH示差法有较好的灵敏度及准确性，pH的选定对生物碱的定量分析具有重要的意义，由于生物碱只有在酸性介质中是稳定的，因此只测定pH小于7条件下生物碱吸光度的变化。分别吸取1 mL样品于9支试管中，分别加入9 mL pH 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0的缓冲溶液，平衡120 min后，以蒸馏水为空白对照，在最大波长下测定吸光度。

1.3.5.4 平衡时间的确定

参考Yu等[30]的方法。吸取1 mL样品，加入9 mL pH 1.5的缓冲溶液，以蒸馏水为空白对照在室温下分别平衡10，20，30，40，50，60，70，80，90和100 min，在最大波长下测定吸光度，用同样的方法测pH 4.5的缓冲溶液的平衡时间。

1.3.5.5 待测样品的制备

准确称取0.1 g干燥的生物碱样品，用70%的乙醇溶解并定容至100 mL。移取2份1 mL样液，分别用pH 1.5和pH 4.5的缓冲液定容至10 mL。待生物碱溶液达到平衡后，测定吸光度，以蒸馏水作参比，用A700nm消除样液浑浊的影响。

1.3.6 生物碱含量的计算

根据Tibor等[31]的研究，结合比耳定律公式A=εbc，得到油莎草块茎中总生物碱含量，按式（2）计算：

式中：X为生物碱质量分数，mg/g；A为吸光度，A=（A1-A0）-（A2-A0），其中A1为pH 1.5波长285 nm下的吸光度，A2为pH 4.5波长285 nm下的吸光度，A0为蒸馏水空白对照；ε为普罗托品的摩尔消光系数，121 986；DF为稀释因子；MW为普罗托品的相对分子质量，331.336；V为最终体积，mL；Wt为产品质量，mg；L为光程，1 cm。

1.3.7 数据处理

使用Origin 2017软件进行图形绘制，用正交助手Ⅱv3.1.1统计软件进行正交试验设计。采用SPSS 22.0对数据进行显著性分析，p＜0.05表示差异显著。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

由图1（A）可知，随着乙醇体积分数增加，生物碱提取得率显著增大，乙醇体积分数增加使生物碱溶解度增加，乙醇体积分数70%时，生物碱提取得率达到最高值。乙醇体积分数大于70%时，随着乙醇体积分数继续增大，生物碱提取得率无显著变化（p＞0.05），故最适乙醇体积分数为70%。由图1（B）可知，随着料液比增大，生物碱的提取得率显著增加，料液比增大至1∶13 g/mL之后，料液比继续增大对生物碱的提取得率无显著影响（p＞0.05），几乎趋于稳定，因此选择1∶13 g/mL为最适料液比。由图1（C）可知，随着提取时间增加，生物碱提取得率逐渐增大，提取时间超过3 h后，随着时间的延长，生物碱的提取得率反而有所降低，因为生物碱是生物活性物质，长时间处于高温环境中会损坏其活性，使提取得率反而减小。所以提取时间不宜过长，保持在3 h以内最好。由1（D）可知，随着提取温度增加，总生物碱提取得率呈现先增加后降低的趋势，提取温度70 ℃时，生物碱提取得率最高，提取温度高于70 ℃以后，随着温度增加，提取得率明显下降，这是由于生物碱是生物活性物质，温度太高，对生物碱的提取有很大的影响，同时温度高耗能也大，因此综合考虑，70 ℃为最适提取温度。

图1 乙醇体积分数（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取温度（D）对油莎草块茎总生物碱提取得率的影响

2.2 正交试验结果

正交试验结果与极差分析见表1，通过SPSS软件得到方差分析结果，见表2。

表1 正交试验结果

表2 方差分析

由表1可知，各因素对总生物碱提取得率的影响分别为A（乙醇体积分数）＞C（提取时间）＞B（料液比）＞D（提取温度），比较K值的大小可以看出，总生物碱最佳提取工艺条件为A1B2C2D2，即乙醇体积分数60%，料液比1∶13 g/mL，提取时间3 h，提取温度70 ℃。用最佳工艺进行验证，重复3次，总生物碱提取得率为1.225 0 mg/g，SRSD值为1.24%（n=3）。

由表2可知，乙醇体积分数和提取时间对总生物碱的提取得率在所考察的范围内影响显著。

2.3 pH示差法测定总生物碱含量

2.3.1 油莎草块茎生物碱吸收光谱图

由图2可知，在紫外可见光谱范围内，油莎草块茎总生物碱的最大吸收波长为285 nm。张伟等[32]采用RP-HPLC同时测定紫金龙中异可利定和普罗托品的含量，结果表明普罗托品在205 nm和285 nm两处有最大吸收，与油莎草块茎中总生物碱的最大吸收峰一致，因此采用普罗托品作为标准品对油莎草块茎总生物碱的含量进行定量分析。

图2 油莎草块茎生物碱吸收光谱图

2.3.2 pH的确定

由图3可知，在pH 1.0～2.0和pH 4.0～5.0这2个范围内，pH的轻微变动对吸光度的影响小，并且生物碱在酸性质中相对稳定。因此，选择的2个pH分别为1.5和4.5。

图3 pH对生物碱吸光度的影响

2.3.3 平衡时间的确定

由表3数据可知，不同平衡时间，生物碱在缓冲液中的吸光度不同。随时间的延长，在pH 1.5的缓冲溶液中生物碱的吸光度上升至80 min以后吸光度稳定；在pH 4.5的缓冲溶液中生物碱的吸光度随时间的延长而升高至100 min时处于稳定。因此生物碱在缓冲液中的平衡时间为100 min 。

表3 油莎草块茎总生物碱在缓冲液中的吸光度与时间变化关系

2.3.4 定量测定生物碱含量

结合比耳定律公式A=εbc，将测得的结果带入式（2）中，计算得油莎草块茎中总生物碱含量为0.706 9 mg/g。

3 结论

采用乙醇回流法提取油莎草块茎总生物碱的最佳工艺参数为乙醇体积分数60%、料液比1∶13 g/mL、提取温度70 ℃、提取时间3 h。在此条件下总生物碱的提取得率为1.225 0 mg/g。

采用pH示差法，用普罗托品作为标准品对油莎草块茎总生物碱的含量进行定量分析。结果表明，未经脱脂处理的油莎草块茎总生物碱含量为0.706 9 mg/g。试验解决油莎草块茎中总生物碱含量测定，为油莎草块茎活性成分生物碱的进一步研究奠定试验基础。