黄精多糖脱蛋白工艺及其抗氧化活性
2021-12-31王莹李锋涛黄美子陈毓徐朋朋钱建中
王莹，李锋涛，黄美子，陈毓，徐朋朋，钱建中*
1. 江苏农牧科技职业学院动物药学院（泰州 225300）；2. 江苏神奇中药科技有限公司（泰州 225528）
黄精为百合科（Liliaceae）黄精属（PolygonatumMill.）多年生草本植物的干燥根茎，属于药食同源中草药，主要分布于北亚热带和北温带[1]。黄精除了具有补气养阴、润肺、益肾的作用，还具有抗衰老、降血压、调节免疫力等作用。黄精含有皂苷、多糖、生物碱等有效成分，多糖作为黄精的主要活性成分之一，具有抗氧化、降血脂以及提高机体免疫能力等药理作用，在食品、医疗等方面具有较好的研究前景[2-4]。近年来，国内多采用水浴醇沉法、超声辅助法等提取多糖，但普遍存在着在提取出多糖的同时，其他可溶性成分如蛋白质也会被提取出来[5-7]。传统的Sevege法、酶法、离子交换色谱法等多糖脱蛋白工艺复杂，效率不高[8-10]。双水相萃取技术是利用物质在两相中不同的分配系数来分离的方法，此法操作简便，室温萃取，不会引起蛋白质的变性[11]。采用双水相法从黄精多糖中萃取蛋白质还未见报道。试验采用双水相体系将黄精多糖水提液中的多糖和蛋白质进行分离，通过单因素试验和响应曲面法探索蛋白质的最佳萃取参数，比较脱蛋白前后黄精多糖抗氧化活性，为黄精多糖的进一步开发提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄精，安徽亳州千草药业有限公司，60 ℃下真空干燥，经多功能粉碎机粉碎，过0.180 mm（80目）孔径筛，所得黄精粉末密封贮藏，备用。
葡萄糖对照品（批号110833-200503，中国食品药品检定研究院）；纤维素酶、果胶酶（国药集团化学试剂有限公司）；其余均为市售分析纯。
1.2 仪器与设备
UV-1800PC-DS2型紫外可见分光光度计（上海美普达）；LE204E电子天平（梅特勒-托利多有限公司）；HH-1数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；HK-02A多功能粉碎机（上海烨昌食品机械有限公司）；RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；TDL-5-A低速离心机（上海安亭科学仪器厂）。
1.3 方法
1.3.1 黄精水提液的制备
称取10 g黄精粉末，加210 mL pH 5.0磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液，混匀，加入1.5%纤维素酶与果胶酶（m纤维素酶∶m果胶酶=1∶1），于50 ℃酶解，在超声清洗器中以功率360 W超声处理30 min，热水浸提，抽滤得黄精水提液，于4 ℃保存。
1.3.2 黄精多糖含量测定
采用苯酚-硫酸法测定黄精多糖含量[12]。葡萄糖标准曲线：y=0.150 3x-0.001 7，R2=0.999 1，表明在10.45～52.25 μg/mL浓度范围内，葡萄糖浓度与其吸光度具有良好线性关系。
1.3.3 黄精水提液中蛋白质含量测定
采用考马斯亮蓝法[13]测定蛋白质的含量，以吸光度（y）对蛋白质浓度（x）回归，得回归方程y=0.139 6x-0.002 8（R2=0.998 1），表明在40～200 μg/mL浓度范围内，蛋白质浓度与其吸光度呈良好线性关系。
精密移取2.00 mL黄精多糖水提液于容量瓶中，按照考马斯亮蓝法[13]测得蛋白质浓度为150.62 μg/mL，后续均采用该浓度的黄精水提液。
1.3.4 黄精水提液中蛋白质的萃取
准确移取5.00 mL黄精水提液于刻度离心管中，称取一定质量的聚乙二醇（PEG），加入不同浓度(NH4)2SO4、KCl，调节pH，充分混匀后于2 000 r/min离心10 min，分相。分别读取上相和下相的体积，测定上下两相中多糖和蛋白质浓度。平行3次取样，得吸光度平均值[11]。
蛋白质的萃取率（E）、多糖回收率（Y）、相比（R）分别根据式（1）～（3）求得。
式中：ct1和cb1分别为萃取完全后蛋白质在上相（PEG相）和下相（硫酸铵相）中的质量浓度，μg/mL；Vt和Vb分别为双水相上相和下相的体积，mL；ct2和cb2分别为萃取完全后多糖在上相（PEG相）和下相（硫酸铵相）中的质量浓度，μg/mL。
1.4 黄精多糖体外抗氧化活性测定
1.4.1 DPPH自由基清除能力测定
取等量相同浓度脱蛋白前后的黄精多糖溶液，配制成0.40，0.80，1.20，1.60，2.00和2.40 mg/mL黄精多糖水溶液，备用。采用DPPH法[14-15]，准确移取4 mL不同浓度的黄精多糖提取液于比色管中，加入预先配制好的2 mL 0.15 mmol/L的DPPH甲醇溶液，摇匀后暗处放置30 min，以样品溶剂为空白，测定其上清液在515 nm波长处的吸光度A，同时测定样品溶液在515 nm处的吸光度A0及DPPH甲醇溶液在515 nm处的吸光度A1；以不同浓度的VC作为阳性对照，平行测定3次。DPPH清除率计算如式（4）所示。
1.4.2 超氧自由基（O2-·）清除率测定
取等量相同浓度脱蛋白前后的黄精多糖溶液，将其配制成0.40，0.80，1.20，1.60，2.00和2.40 mg/mL黄精多糖水溶液，备用。准确移取4 mL不同浓度的黄精多糖提取液于试管中，依次加入4 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 8.2）和4 mL 20 mmol/L的邻苯三酚溶液，水平摇匀后，于25 ℃水浴10 min，加入4 mL 1% HCl溶液，于325 nm测定吸光度（Ax），以相同体积蒸馏水作为空白对照，空白对照组吸光度A0[16-17]，以不同浓度VC作为阳性对照，平行测定3次，O2-·清除率计算如式（5）所示。
2 结果与分析
2.1 双水相体系相图
PEG/(NH4)2SO4双水相体系相图如图1所示，曲线上的点为临界点，曲线下方属于单相区，曲线上方属于双相区。PEG浓度一定时，(NH4)2SO4浓度越低，越不容易分相。PEG的相对分子量越大，形成双水相的临界浓度越低。此相图为双水相萃取黄精多糖中的蛋白质提供理论依据。
图1 PEG/(NH4)2SO4双水相体系相图
2.2 单因素试验
2.2.1 PEG相对分子量对蛋白质萃取率的影响
准确量取5.00 mL黄精水提液于5个刻度离心管中，称取相同质量的PEG 1 500、PEG 2 000、PEG 4 000、PEG 6 000、PEG 8 000，PEG、(NH4)2SO4、KCl，浓度分别固定为16%，18%和0.5%，混合均匀，调至pH 6.0，摇匀，离心机转速设为2 000 r/min，离心10 min。
由图2可知，PEG分子量增大时，上相体积逐渐变大，下相体积逐渐变小，R由0.63%增大至0.71%，变化不大。而E和Y均先增大后减小，即在PEG 4 000双水相萃取系统中，蛋白质的萃取率和多糖的回收率均达到最高，故选择PEG分子量4 000。
图2 不同分子量PEG对蛋白质的萃取率影响
2.2.2 PEG 4 000浓度对蛋白质萃取率的影响
准确量取5.00 mL黄精水提液于5个刻度离心管中，(NH4)2SO4和KCl浓度分别固定为18%和0.5%，加入不同浓度的PEG 4 000（12%，14%，16%，18%和20%），混合均匀，调pH 6.0，摇匀，离心机转速设为2 000 r/min，离心10 min。
由图3可知，随着PEG 4 000浓度增加，R逐渐增大，E先增大后减小，Y变化不大，这是因为增加PEG 4 000浓度，会使成相物质总浓度增加，进而使萃取相极性变小，而蛋白质是具有部分极性的非极性物质，故其在萃取相中的溶解度增加，促使E增加。继续增加PEG 4 000浓度，可能会导致溶液的黏度增大，阻碍相分子之间的转移，使下相中的蛋白质滞留在两相之间，导致E减小[18]。因此，PEG 4 000最佳浓度为18%。
图3 PEG 4 000浓度对蛋白质萃取率的影响
2.2.3 (NH4)2SO4浓度对蛋白质萃取率的影响
准确量取5.00 mL黄精水提液于5个刻度离心管中，PEG 4 000和KCl浓度分别固定为16%和0.5%，加入不同浓度的(NH4)2SO4（12%，14%，16%，18%和20%），混合均匀，调pH 6.0，摇匀，离心机转速设为2 000 r/min，离心10 min。
(NH4)2SO4浓度对蛋白质萃取率的影响如图4所示，PEG 4 000浓度一定时，随着(NH4)2SO4浓度增大，下相的吸水能力增强，体积成增大趋势，故R逐渐减小。多糖回收率Y变化不大，蛋白质萃取率E先增大后减小，(NH4)2SO4浓度达到16%时，E达到最大值80.75%，这可能是因为(NH4)2SO4在一定范围内，浓度越大，无机盐的盐析作用越强，蛋白质在萃取相中的浓度越大，E越大，但(NH4)2SO4浓度过大时，无机盐会影响蛋白质表面疏水性，使E减小[19]。因此，(NH4)2SO4最佳浓度为16%。
图4 (NH4)2SO4浓度对蛋白质萃取率的影响
2.2.4 pH对蛋白质萃取率的影响
准确量取5.00 mL黄精水提液于5个刻度离心管中，PEG 4 000、(NH4)2SO4和KCl浓度分别固定为16%，18%和0.5%，混合均匀，调节不同pH（pH 5.5，6.0，6.5，7.0和7.5），摇匀，离心机转速设为2 000 r/min，离心10 min。
Sarangi等[20]发现双水相的pH能够改变两相的相位，pH与蛋白质的等电点相差越大，蛋白质在两相中的分配越不均匀，pH的微小变化可能使蛋白质的分配系数发生大幅改变。pH对蛋白质萃取率的影响如图5所示，pH增大时，R和Y变化不大，E先增大后减小，pH 6.5时，E达到80.27%。因此，最佳pH为6.5。
图5 pH对蛋白质萃取率的影响
2.2.5 KCl浓度对蛋白质萃取率的影响
准确量取5.00 mL黄精水提液于5个刻度离心管中，PEG 4 000和(NH4)2SO4浓度分别固定为16%和18%，加入不同浓度KCl溶液（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%），混合均匀，调pH至6.0，离心机转速设为2 000 r/min，离心10 min。
KCl浓度对蛋白质萃取率影响如图6所示。随着KCl浓度增加，R和Y变化不大，E先增加后减小，这可能是因为在双水相中加入不同浓度KCl溶液可使体系的电荷和疏水状态发生改变，从而影响蛋白质在两相中的分配比例。KCl浓度在一定范围内时，KCl的加入可促进蛋白质溶解，E逐步上升，当KCl浓度过大，会使萃取相的极性增强，促使E下降[21]，故KCl最佳浓度为1%。
图6 KCl浓度对蛋白质萃取率的影响
2.3 响应曲面法优化萃取工艺
2.3.1 响应面试验结果
根据单因素分析结果，以PEG 4 000浓度（A）、(NH4)2SO4浓度（B）、pH（C）、KCl浓度（D）为自变量，以蛋白质萃取率为响应值（Y），按照Box-Behnken设计法对黄精多糖脱蛋白萃取工艺进行优化，分析因素与水平设计见表1，响应面试验设计及结果见表2。
表1 响应面试验分析因素与水平
表2 响应分析因素与水平
通过Design-Expert 10.0.3软件将模型进行分析，拟合得到影响黄精得率的回归方程：得率Y=82.36-0.59A+1.49B+0.56C-0.084D-0.21AB-0.77AC+0.58AD+0.64BC-1.20BD-0.45CD-4.28A2-6.51B2-5.10C2-1.20D2。
由表3可知，建立的模型的F值为57.48，p＜0.000 1，说明该模型极显著，失拟项p=0.447 4＞0.05，不显著，说明模型适合试验，可用于黄精多糖蛋白质萃取的工艺优化。该模型决定系数R2值为0.982 9，校正后决定系数R2adj值为0.965 8，说明该模型能解释96.58%的响应变化。表中A、B、C、BD、A2、B2、C2、D2对蛋白质萃取率差异显著（p＜0.05），D、AB、AC、AD、BC、CD项不显著（P＞0.05），将此7项从回归方程中删除，最终的回归方程：Y=82.36-0.59A+1.49B+0.56C-1.20BD-4.28A2-6.51B2-5.10C2-1.20D2。
表3 回归模型方差分析
2.3.2 蛋白质萃取率的响应面分析
图7表示各影响因素两两作用蛋白质萃取率的交互影响。从响应曲面分析，(NH4)2SO4浓度对蛋白质萃取率影响最大，表现为响应曲面最陡，其后影响因素依次为PEG 4 000浓度、pH、KCl浓度，与方差分析结果一致。
图7 各因素交互影响蛋白质萃取率的曲面图
2.3.3 模型验证
通过建立的模型，预测蛋白质萃取率最佳工艺：PEG 4 000浓度17.825%、(NH4)2SO4浓度16.265%、pH 6.538、KCl浓度0.932%。蛋白质萃取率为82.515%，考虑实验操作的可控性，对上述最优提取工艺进行修正：PEG 4 000浓度18%、(NH4)2SO4浓度16%、pH 6.5、KCl浓度1%。在此条件下进行验证试验，平行测定3次，求平均值，结果得出多糖回收率为91.29%，蛋白质萃取率为82.78%，与预测值82.52%较为接近，表明该模型能够预测蛋白质萃取的最佳工艺，模型可靠。在此工艺下，蛋白质的萃取率比酶法脱蛋白高出11.55%，多糖回收率高4.99%[9]。
2.4 黄精多糖抗氧化作用分析
2.4.1 黄精多糖清除DPPH
由图8可知，同浓度时，VC对DPPH清除能力明显大于黄精多糖。黄精多糖的清除能力与其浓度呈现明显的量效关系，即随着黄精多糖浓度增加，其清除DPPH自由基能力逐渐增强，而后趋于平缓，且脱蛋白后的黄精多糖对DPPH清除能力优于未脱蛋白的黄精多糖。黄精多糖浓度达到2.00 mg/mL时，脱蛋白前后的黄精多糖对DPPH清除能力分别为66.95%和78.96%。由此可见，脱蛋白后的黄精多糖对DPPH自由基清除能力更强。
图8 黄精多糖和VC对DPPH自由基的清除作用
2.4.2 黄精多糖清除超氧自由基O2-·
图9 黄精多糖和VC对O2-·清除作用
3 结论
试验采用聚乙二醇（PEG）-硫酸铵双水相体系将黄精多糖与蛋白质进行分离，通过响应曲面法进行优化，得到蛋白质最佳萃取参数：黄精多糖溶液5.0 0 mL、PEG 4 000浓度18%、(NH4)2SO4浓度16%、pH 6.5、KCl浓度1%，此时蛋白质萃取率为82.78%，多糖回收率为91.29%，在此工艺下，蛋白质萃取率和多糖回收率较酶法脱蛋白分别高出11.55%和4.99%。黄精多糖具有一定的抗氧化能力，但明显不及同浓度VC的抗氧化能力，同浓度脱蛋白后的黄精多糖抗氧化能力优于未脱蛋白黄精多糖。试验结果为高效开发黄精多糖食品和药品奠定基础。
