超声细胞破碎法提取黑果枸杞原花青素

谭永鹏，李映伟，程建华*

1. 华南理工大学化学与化工学院（广州 510640）；2. 华南协调创新研究院（东莞 523808）

黑果枸杞是茄科、枸杞属多棘刺野生灌木植物，多分布在我国西北地区，可防止土壤沙漠化和盐碱化，具有水土保持、防风固沙和改善环境的功能[1-3]。黑果枸杞有“软黄金”之誉，其果实呈黑紫色圆球状，含有丰富的花色苷、氨基酸、多酚类化合物、生物碱类化合物等多种营养成分和生物活性成分，尤其含有丰富的天然原花青素，营养保健及药用价值极高[4-7]。

原花青素是一大类多酚类化合物的总称，广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果、种子等部位，由于其能够在热酸性条件下产生花青素，因而被命名为原花青素[8]。原花青素是由不同数量的黄烷-3-醇单体聚合而成的高分子量多酚化合物，可以显著清除自由基及抑制脂质过氧化，是公认的天然抗氧化剂和自由基清除剂[9-10]，具有抗紫外线、抗辐射、抗肿瘤、改善炎症、调节免疫等多种生理作用，在食品、保健品、药品和化妆品等领域具有广泛的应用前景[11-12]。

以黑果枸杞为原料，采用超声细胞破碎法对其中的原花青素进行提取，具有操作简单、便捷高效、提取率高、成本低等特点[13]；以原花青素得率为评价指标，采用响应面设计法优化黑果枸杞原花青素的提取工艺，同时研究分析其抗氧化活性，为黑果枸杞的研究、开发和利用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果枸杞（青海诺木洪枸杞产业园区）；原花青素标准品（上海源叶生物科技有限公司）；香草醛、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼、DPPH、抗坏血酸、VC（阿拉丁）；无水乙醇、甲醇、浓盐酸（天津市大茂化学试剂厂）。

1.2 仪器与设备

FW80型高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；BS224S电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；U-2910型紫外可见光分光光度计（HITACHI公司）；JY92-Ⅱ N型超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技有限公司）；RV-3C旋转蒸发仪（IKA仪器设备有限公司）；LGJ-12真空冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 黑果枸杞原花青素含量测定

1.3.1.1 标准曲线的绘制

采用改良的浓盐酸-香草醛法[14]测定原花青素的含量。称取20 mg原花青素标准品，用甲醇定容至20 mL，配制成1 mg/mL的原花青素标准溶液，分别移取1，2，3，4和5 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，各取1 mL至25 mL比色管中，依次加入6.0 mL 4%香草醛甲醇溶液和3.0 mL浓盐酸，混匀后在30±1 ℃的恒温水浴中避光反应20 min，然后以甲醇溶液作为空白，在500 nm的波长下用紫外分光光度计测定吸光度，绘制标准曲线，得到回归方程y=0.948x-0.000 8，R2=0.999 3，其中x为原花青素的质量浓度，mg/mL；y为500 nm下的吸光度。

1.3.1.2 样品中原花青素含量的测定

将黑果枸杞粉碎后过0.25 mm孔径筛，准确称取2.0 g黑果枸杞粉末，按设定的料液比加入一定体积分数的乙醇，在设定的功率下进行超声细胞破碎提取，提取结束后，离心收集上清液并定容至一定体积（视情况而定），移取1 mL提取液替代上述方法中的标准液测定吸光度，重复测定3次，按式（1）计算样品中原花青素得率[15]。

式中：N为稀释倍数；C为粗提液中原花青素的质量浓度，mg/mL；m为黑果枸杞的质量，g；V为粗提液定容后的体积，mL。

1.3.2 单因素试验设计

称取2.0 g黑果枸杞粉末，按照料液比1∶30（g/mL）加入50%的乙醇水溶液，在超声功率为200 W、超声开/关时间为50 s/10 s的条件下超声25 min，测定黑果枸杞原花青素的得率。固定其他反应条件，分别考察料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30和1∶35 g/mL）、乙醇体积分数（30%，40%，50%，60%，70%和80%）、超声时间（10，15，20，25，30和35 min）、超声功率（100，200，300，400，500和600 W）对原花青素得率的影响。

1.3.3 Box-Behnken试验设计

在单因素试验基础上，以原花青素得率作为响应值，对超声时间（A）、乙醇体积分数（B）、料液比（C）、超声功率（D）进行条件优化，每个因素选取3个最靠近原花青素得率最大处的水平，进行四因素三水平的响应面分析试验，优化超声细胞破碎法提取原花青素的工艺。

表1 响应面试验因素及水平表

1.3.4 黑果枸杞原花青素抗氧化活性研究

1.3.4.1 DPPH自由基清除活性

黑果枸杞原花青素DPPH自由基清除活性的测定参照Shimada等[16]的方法。先配制浓度为0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，然后分别将2.5 mL质量浓度为5，10，15，20，25和30 μg/mL的原花青素样液和2.5 mL DPPH乙醇溶液混合，室温避光反应20 min后，在517 nm处测溶液吸光度A1，然后以2.5 mL 95%的乙醇代替DPPH乙醇溶液测得吸光度A2，再以2.5 mL蒸馏水代替样液测得吸光度A3。DPPH自由基清除率按式（2）计算。

式中：A1为2.5 mL原花青素样品溶液+2.5 mL DPPH乙醇溶液的吸光度；A2为2.5 mL原花青素样品溶液+2.5 mL 95%乙醇的吸光度；A3为2.5 mL蒸馏水+2.5 mL DPPH乙醇溶液的吸光度。

1.3.4.2 总抗氧化能力

总抗氧化能力的测定参考Ozkan等[17]的方法。在比色管中依次加入1.0 mL H2SO4溶液（3.0 mol/L）、1.0 mL Na3PO4溶液（0.14 mol/L）和1.0 mL钼酸铵溶液（0.02 mol/L），再加入1.0 mL质量浓度分别为0.01，0.02，0.04，0.06，0.08和0.1 mg/mL的原花青素样液，用蒸馏水定容至5.0 mL，充分摇匀，在95 ℃的水浴中加热90 min，取出冷却后在波长695 nm下测定吸光度，以VC作阳性对照，以蒸馏水代替样液作空白，吸光度越大说明样品的总抗氧化能力越强。

1.3.5 数据处理

采用Excel 2018软件对数据进行整理分析，采用Origin 8.0制作图表，采用Design-Expert 8.06软件进行响应面试验的设计及结果分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果及分析

2.1.1 料液比对原花青素得率的影响

由图1可知，当料液比增大时，原花青素得率也逐渐升高，这是因为随着料液比的增大，提供给原花青素析出的空间增大，原花青素的得率也逐渐升高；一定质量的黑果枸杞含有原花青素的量是一定的，因此当料液比为1∶30（g/mL）时得率达到最大值[18]。为了降低成本、减少溶剂的浪费及缩短后继减压蒸馏步骤的时间，提取的最佳料液比选择1∶30（g/mL）。

图1 料液比对原花青素得率的影响

2.1.2 乙醇体积分数对原花青素得率的影响

如图2所示，随着乙醇体积分数逐渐增大，溶剂对细胞壁的穿透作用增大，对氢键的破坏能力增强，原花青素的得率也逐渐升高。通过调节乙醇-水配比改变溶液极性，当乙醇体积分数为50%时，溶剂极性与原花青素极性相当，利于原花青素的析出，得率达到最大值[19]。当继续增大乙醇体积分数时，脂溶性杂质大量析出，与原花青素竞争与乙醇-水分子的结合，使原花青素得率下降。因此乙醇体积分数选择50%。

由于委派制在某种程度上的“过渡性”和“不彻底性”，审计人员的专业化、系统化的培训较少，人员专业素养提升较慢，难以胜任日益复杂的审计业务要求。

图2 乙醇体积分数对原花青素得率得影响

2.1.3 超声时间对原花青素得率的影响

从图3可以看出，原花青素的得率随超声时间的增加呈现先上升后下降的趋势，在25 min达到最大值。原因在于：超声时间不足会造成原花青素的提取不够充分，原花青素未能充分析出；超声时间过长则会使提取液温度逐渐上升，长时间的过高温度会破坏原花青素的酚羟基结构，还会增加其他杂质的溶出，进而导致原花青素的得率降低[20]。因此超声破碎时间选择25 min。

图3 超声时间对原花青素得率的影响

2.1.4 超声功率对原花青素得率的影响

由图4可知，随着超声功率的增大，原花青素得率呈现先增加后降低的趋势，在超声功率为200 W时得率最大，之后随着功率的增加得率逐渐降低。超声产生的强烈搅拌振荡作用和空化效应利于料液间的充分接触，加速细胞破碎，进而促使胞内有效成分溶出。但超声破碎功率增大到一定程度后，提取液会出现空化泡，减少能量的传递，不利于原花青素提取。当超声功率过大时，其产生的热效应、空化效应和机械作用过强，导致原花青素发生降解，使得率降低[21]。因此，超声细胞破碎的功率选择200 W。

图4 超声功率对原花青素得率的影响

2.2 响应面试验设计的结果及分析

2.2.1 模型的建立及数据分析

在单因素试验的基础上，以原花青素得率为响应值，选取超声时间（A）、乙醇体积分数（B）、料液比（C）、超声功率（D）为影响因素，根据Box-Behnken试验设计原理，进行四因素三水平的响应面分析，试验设计及结果如表2所示。对其进行多元回归分析，得到预测模型：Y=6.12+0.16A-0.043B-0.084C+0.21D+0.093AB+0.05AC-0.12AD-0.03BC-0.16BD-0.042CD-0.32A2-0.34B2-0.26C2-0.5D2。

表2 响应面试验设计及结果

对该模型进行显著性检验，由表3方差分析表可知：模型的p值＜0.000 1，差异极显著（p＜0.01），说明该回归模型是有效可靠的，有较好的统计学意义；模型的失拟项p=0.143 8＞0.05，失拟项不显著，说明回归方程的拟合度高，其他外来因素对试验结果的影响较小；相关系数R2=0.932 1，Radj2=0.864 2，说明该模型能预测85%以上的响应值的变化，预测值与真实值有较高的相关性，可以用该模型对黑果枸杞原花青素的提取工艺进行预测。

表3 方差分析表

根据F检验可得：回归方程的一次项A，D极显著，C显著（p＜0.05），各因素对原花青素得率的影响由大到小排列为D＞A＞C＞B，即超声功率＞超声时间＞料液比＞乙醇体积分数；交互项只有BD显著，说明只有乙醇体积分数及超声功率对原花青素得率有明显的交互作用；二次项A2、B2、C2、D2均影响极显著，表明各因素对响应值并非简单的线性关系。

2.2.2 响应面分析

响应面图可以直观反映超声时间、乙醇体积分数、料液比和超声功率对原花青素得率的影响。如图5所示：超声功率对黑果枸杞原花青素得率的影响最大，表现在图上的响应曲面沿着超声功率的方向的坡度较大、较陡，超声时间及料液比次之；乙醇体积分数对得率的影响不显著，表现在图上的坡度较平缓。响应曲面坡度陡峭则表示两因素间交互作用强，如图中的超声功率与乙醇体积分数之间的交互作用显著，而其余各因素的响应面坡度较小，表明其交互作用不显著，这与回归方程的方差分析结果一致。

图5 各因素对原花青素得率影响的响应面曲线图

2.2.3 最优工艺条件的确定与验证

利用Design-Expert 8.0软件，分析得出超声细胞破碎法提取黑果枸杞原花青素的最佳提取工艺：超声时间25.95 min、乙醇体积分数49.21%、料液比1∶29.22（g/mL）、超声功率220.25 W。在此条件下，原花青素得率为6.17%；为方便实际操作，将试验条件定为超声时间26 min、乙醇体积分数50%、料液比1∶29（g/mL）、超声功率220 W。在调整后的工艺条件下做3次重复试验验证，得到的黑果枸杞原花青素得率分别为6.14%，6.07%和6.11%，平均得率为6.107%，与预测值的相对误差为1.02%，重复性较好，工艺可靠，具有一定的实用价值。

2.3 黑果枸杞原花青素抗氧化活性的研究

2.3.1 DPPH自由基清除活性

如图6所示：随着黑果枸杞原花青素质量浓度的增加，其对DPPH自由基的清除率逐渐升高，在质量浓度为25 μg/mL时，原花青素对DPPH自由基的清除率接近100%；与黑果枸杞原花青素相比，VC对DPPH自由基有较强的清除作用，在20 μg/mL时就基本可以将DPPH自由基完全清除；两者在较低浓度时对DPPH自由基有较强的清除作用，对DPPH自由基的清除用作呈现浓度依赖性，在高于25 μg/mL时，两者对DPPH自由基的清除作用相当，说明黑果枸杞原花青素拥有较强的DPPH自由基清除能力。

图6 黑果枸杞原花青素对DPPH自由基的清除能力

2.3.2 总抗氧化能力

由图7可以看出：黑果枸杞原花青素和VC的总抗氧化能力呈现浓度依赖性，质量浓度越大，总抗氧化能力越强；在低浓度时，原花青素的总抗氧化能力高于VC；当质量浓度大于0.06 mg/mL时，总抗氧化能力略低于VC，说明黑果枸杞原花青素具有较强的抗氧化能力。

图7 黑果枸杞原花青素的总抗氧化能力

3 结论

采用响应面法优化超声细胞破碎提取黑果枸杞中原花青素的工艺，在单因素试验的基础上，研究单个因素间及其交互作用对原花青素得率的影响，得到的优化工艺条件为超声时间26 min、乙醇体积分数50%、料液比1∶29（g/mL）、超声功率220 W。在此条件下，原花青素的得率为6.10%±0.03%，与预测值6.17%相比，相对误差为1.02%，说明该回归模型的拟合度较好，对优化黑果枸杞原花青素的提取工艺有指导意义。同时体外抗氧化试验表明，黑果枸杞原花青素在质量浓度为25 μg/mL时，其对DPPH自由基的清除率能达到97%，总抗氧化能力与VC相当，说明黑果枸杞原花青素具有较强的自由基清除活性和抗氧化活性。