山西省普通菜豆核心种质普通细菌性疫病抗性的鉴定和评价

王 燕 郝晓鹏 赵建栋 董 雪 畅建武

（山西农业大学农业基因资源研究中心，山西省农业科学院农作物品种资源研究所，农业农村部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西太原 030031）

普通菜豆（Phaseolus vulgarisL.）是山西省杂粮种植中重要的食用豆类作物之一，其中红芸豆（red kidney bean）是最主要且种植面积最大的一个粮、菜、饲兼用栽培品种。目前，山西省红芸豆的种植面积在3.3 万hm2左右（郝晓鹏 等，2019），每667 m2产量在100～200 kg，主要种植于晋西北、晋北和吕梁山区等无霜期在120 d 以内的高寒冷凉半干旱区。该区域生产的红芸豆籽粒饱满、色泽鲜艳，优质的商品性使其在国际市场上颇受欢迎，成为山西省重要的出口贸易型特色农产品。红芸豆成熟干籽粒富含蛋白、膳食纤维、必需氨基酸、维生素、钾、镁、α-淀粉酶抑制剂、花色苷类等营养和功能物质（程须珍和王述民，2016），鲜荚富含膳食纤维、多种矿物质、VA 和VC（王述民，1993），籽粒和嫩荚作为主要的生产和加工对象，以粥、糕点、菜肴等形式成为人们膳食和动物饲料中重要的植物蛋白质和膳食纤维的来源。

红芸豆自引进山西种植30 年以来，虽然通过改良品种和改进栽培技术提升了产量，但是随着连年种植，各种病害问题逐年加剧，包括普通细菌性疫病、晕疫病、根腐病、枯萎病等，其中由地毯草黄单胞杆菌菜豆致病变种（Xanthomonas axonopodispv.phaseoli）及褐色黄单胞菌褐色亚种（Xanthomonas fuscanssubsp.fuscans）引起的普通细菌性疫病是对红芸豆生产危害最严重的细菌性病害，因该病原菌主要通过带菌种子进行传播，加之不同生产地的种子交叉种植，很容易造成该病在不同地区间的大面积传播和流行。目前普通细菌性疫病在山西省各产区每年均有不同程度的发生，而且该病害可在整个生育期发生，可危害植株不同组织，故病害一旦发生，严重的可造成50%以上的减产且籽粒商品性降低（Marquez et al.，2007）。

目前，生产上主要通过化学防治和种植抗病品种来减少普通细菌性疫病对红芸豆产业造成的不利影响。喷施农药防治效果有限，同时增加了生产和劳动力成本，还会对环境造成一定的危害；抗病品种选育虽然周期长，但能从根本和源头上解决和杜绝病害的发生。国外学者通过资源鉴定（Michaels et al.，2005；Mutlu et al.，2005a，2005b；Miklas et al.，2006）、杂 交（Park &Dhanvantari，1994；Beaver et al.，2010）及分子标记辅助等手段创制了一批抗性材料；国内学者也通过接种鉴定筛选出菜豆资源抗性材料（徐新新，2012；朱吉风 等，2015），但国内外的研究结果都未发现普通菜豆对普通细菌性疫病免疫的材料，高抗及抗性材料也很少，因此筛选抗性资源对于抗病育种工作仍是一项紧迫和重要的基础工作。山西省拥有全国近1/5 的普通菜豆资源，本试验拟通过对这些资源构建的核心种质进行抗性鉴定和评价，从中挖掘抗性资源，实现资源的有效利用。

1 材料与方法

1.1 供试材料

鉴定的151 份普通菜豆种质材料为利用山西省农业科学院农作物品种资源研究所保存的663 份普通菜豆资源所构建的初级核心种质（郝晓鹏 等，2016），材料具体编号、名称见表1。

试验接种用病原菌来自2018 年山西省晋中市榆次区东阳镇试验基地红芸豆田中具有普通细菌性疫病典型发病症状的植株叶片。取病健交界处叶片，利用牛奶吐温选择性培养基和肉汁胨培养基（徐新新，2012）多次分离纯化获得菌株。分离菌株经上海桑尼生物科技有限公司测序和菜豆普通细菌性疫病病原菌特异性引物PCR 扩增测序比对后，综合鉴定结果为地毯草黄单胞杆菌菜豆致病变种。

1.2 接种幼苗和接种菌液准备

2018 年10月在山西省农业科学院农作物品种资源研究所内开展接种试验。每份供试材料选取性状一致、大小均匀、无破损霉变的8 粒种子，无菌水清洗3 次后均匀播种于直径9 cm 的营养钵中，每钵播4 粒，共2 钵，放置于温度25 ℃、湿度50%的种子发芽室内生长，营养土不定期浇水，保持湿润状态。待所有材料幼苗的第1 对真叶完全平展、叶片长度4 cm 左右时即可接种。

材料能够接种前4 d 左右，将保存于-80 ℃的纯化菌株于肉汁胨培养基上重新分离纯化，再挑取单菌落在盛有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中28 ℃ 200 r·min-1振荡培养48 h 左右，酶标仪测定菌液OD 值约为0.5 左右时用于接种。

1.3 接种

基于Zapata（2006）和朱吉风等（2015）的接种方法，利用英国红芸豆、品金芸2号、品金芸4号、花皮连豆、黑金豆等5 份材料进行病原菌接种方法的改良，核心种质的鉴定采用改良后的对生真叶穿刺接种法于种子发芽准备室完成。每份材料的不同单株作为重复，每株选取1 片发育正常的真叶，以中间叶脉为间隔，距离叶脉1 cm 处，与其平行方向刺穿3 个点，点与点之间相隔1 cm，每点接种10 μL 菌液；用同样的方式在叶片的另一半接种灭菌培养基。

随即将接种后的菜豆幼苗置于人工气候箱28℃ 12 h/20 ℃12 h、湿度（80 ± 5）%直至有接种幼苗发病，转移至光照培养室25 ℃ 湿度（55 ± 5）%条件下管理，期间随时根据基质干湿情况补充水分。接种14 d 后调查叶片的发病情况。

1.4 抗病性调查

接种叶片接种区的病害分级依据病害分级标准（Zapata et al.，2006），并参照对生真叶穿刺接种叶片发病分级图（图1）来确定。

参考朱吉风等（2015）的公式计算各材料所有接种叶片的平均发病级别：

公式中：Xi代表发病级别；ai代表各级病叶数；Σai代表调查的总叶片数。

材料的抗性划分标准（朱吉风 等，2015）为：抗病（R），X ≤2；中抗（MR），2 ＜X ≤4；感病（S），4 ＜X ≤8；高感（HS），X ＞8。

1.5 数据分析

采用EXCEL 和SPSS 19.0 数据处理软件进行数据分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 改良接种方法的接种结果

本试验采用对生真叶穿刺接种法对材料进行抗性鉴定，该方法是在参照Zapata（2006）和朱吉风等（2015）的接种方法的基础上进行改良，将接种部位由第1 片三出复叶的中间小叶改为对生真叶，接种量从吸有菌液的枪头刺穿叶片增加到穿刺注射10 μL 菌液，接种后管理从温室转换到人工气候箱和光照培养室。5 份材料英国红芸豆、品金芸2号、品金芸4号、花皮连豆、黑金豆接种14 d 后，真叶接种区的发病程度与同一品种三出复叶中间小叶的发病情况一致（图2），表明改良的接种方法能确保有效侵染发病。而且改良后的接种方法能将接种时间从原来的25 d 左右缩减至15 d 左右，提前10 d 左右。

2.2 初级核心种质抗病性鉴定结果

利用对生真叶穿刺接种法对151 份山西省普通菜豆初级核心种质进行抗病性鉴定，每份种质的平均发病级别和抗性等级结果具体见表1。

表1 普通菜豆初级核心种质普通细菌性疫病抗性鉴定结果

续表

续表

发病鉴定结果显示，151 份初级核心种质平均发病级别在1.5～10.0 之间，所有种质发病级别平均为6.7，总体发病偏重。抗性分级结果显示，所有种质中抗病种质极少，仅有1 份，占总数的0.7%，为C132（F0001696，无丝豆角），该种质植株株型直立，主茎节数10 节，粒形肾形，种皮红色斑纹，百粒重35～40 g，可作为改良红芸豆抗性和株型的优异抗源材料；中抗种质34 份，占总数的22.5%；感病种质为59 份，占总数的39.1%；高感种质为57 份，占总数的37.7%。山西普通菜豆初级核心种质多数对普通细菌性疫病表现感病，感病及高感种质占到总数的76.8%。

2.3 35 份抗性种质聚类分析

基于农艺性状和抗性鉴定结果对35 份中抗以上的核心种质采用离差平方和法进行系统聚类，从图3 的聚类图中可见，在相对遗传距离的阈值为5时，将种质分成3 大类群，每个类群在生育期、植株类型、荚及籽粒等方面具有不同的特征。

结合表2 可知，第Ⅰ类群包含19 份种质，占到半数以上，其生育期较短；株矮节少、全部直立有限生长；单株荚数、单荚粒数均较少；产量低；籽粒以肾形无斑纹为主。第Ⅱ类群仅包含4 份种质，其生育期较长；株高节多，全部蔓生无限生长；单株荚数、单荚粒数多且荚长；产量高；籽粒全部为肾形无斑；第Ⅲ类群包含12 份种质，生育期长、晚熟；株高介于Ⅰ、Ⅱ类群之间，蔓生或半蔓生无限生长；荚多且短、单荚粒数少；产量中等；籽粒卵圆或椭圆形，无斑纹或黑白斑。不同粒色的种质在3 个类群中分布都很丰富，平均发病级别在3 个类群间相差小。

表2 不同类群种质主要性状统计

3 结论与讨论

目前，解决农业生产中品种抗病性差的最根本、经济环保、可持续的方法就是选育高抗病品种，通过抗病性鉴定可以快速从大量种质资源中筛选出抗性材料或品种。现阶段普通菜豆抗普通细菌性疫病的鉴定基本采用在特定温室条件下针刺三出复叶的接种方法（Zapata &Beaver，2011），该方法与田间苗期喷雾接种鉴定相比，具有试验规模小、发病条件相对稳定易控和管理方便等优点，本试验在上述方法基础上从接种的部位、发病的环境条件及后期的管理方面进行了改进，采用在人工气候箱和光照培养室条件下穿刺对生真叶的鉴定方法，可以将接种时间提前10 d 左右，人工气候箱和光照培养室的温度、湿度条件更加可控且不受外界影响，电子控制也使后期管理更加便利，利用此方法鉴定的5 份材料的抗性与朱吉风等（2015）的鉴定结果基本一致，因此，在试验条件允许的情况下可将其作为一种普通菜豆抗普通细菌性疫病鉴定的更为时效便捷的手段。

本试验鉴定的151 份材料是利用山西种质库现有663 份普通菜豆资源构建的初级核心种质，基本囊括了山西现有普通菜豆资源的主要类型，利用对生真叶穿刺接种法鉴定到34 份中抗及1 份抗病材料，占所有资源的23.2%，没有鉴定出对该病害免疫的材料。国内学者也从不同的普通菜豆资源中鉴定出2 份抗病资源（朱吉风 等，2015）和10 份抗病资源（徐新新，2012），从现有的研究来看国内普通菜豆对普通细菌性疫病的抗性资源非常稀缺，目前也未见对该病害完全免疫的资源的相关报道，因此需要通过加大资源的鉴定范围或者引进国外丰富的菜豆资源来挖掘抗性材料。同时也要加强对已鉴定抗性资源的利用和改良，本试验中鉴定的抗病种质F0001696 无丝豆角是1 份与红芸豆植株性状和籽粒相近的矮生、肾形、种皮绝大部分为红色的资源，且还具有茎节多的优良农艺性状，因目前生产上种植的红芸豆品种遗传背景单一，对普通细菌性疫病多表现为中抗或感病，故F0001696 可作为红芸豆品种改良和创制的优质亲本材料。

结合菜豆农艺性状和抗性鉴定结果对35 份表现抗病和中抗的种质进行聚类分析，可以更全面地了解资源，以便实现资源合理有效的利用。聚类分析结果将抗性种质划分为在物候期、植物学形态特征、农艺性状等方面具有典型特点的3 大类群，可以有目的地从不同类群中选择资源直接利用，或者用于改良感病但高产优质的材料，也可作为遗传研究的基础材料等，使资源在解决研究和生产中的瓶颈问题时发挥其最大的优势和价值。