EB病毒相关性移植后淋巴组织增生性疾病生物标志物的相关进展

艾亮 张盛 王强 李夏 成柯

爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus，EBV）相关性移植后淋巴组织增生性疾病（posttransplant lymphoproliferative disease，PTLD）是造血干细胞及实体器官移植术后因免疫功能障碍导致从多克隆增生到非霍奇金淋巴瘤的一组疾病[1]。EBV是隶属于γ疱疹病毒的DNA病毒，人类是其唯一宿主，主要侵袭人B细胞与口咽部上皮细胞。EBV人群易感性高，主要通过飞沫传播，实体器官移植受者还可能经由EBV血清学阳性的供者或输注未去除白细胞成分的血制品感染。PTLD是一系列异质性疾病病变，包括病理类型、临床特征和预后异质性等。病理学类型表现可以从反应性多克隆B细胞良性增生到恶性侵袭性的淋巴瘤，超过70%与EBV感染相关[1-2]。

EBV相关性PTLD是儿童器官移植受者中最常见的恶性肿瘤，在儿童肾移植受者中发生率为3%～7%，其发展迅速并可能致命，病死率约为50%[3-4]。EBV相关性PTLD的治疗方案包括减少或撤除免疫抑制剂、化学药物治疗、放射治疗、抗CD20抗体利妥昔单抗治疗及手术切除等[5]。 然而， 这些方法的疗效尚未确定，复发率和治疗相关的病死率高是目前临床面临的主要问题，且缺乏个体化治疗方案，最佳治疗方案尚没有形成共识。鉴于这些挑战，迫切需要开发微创生物标志物，以改善器官移植受者EBV相关性PTLD的早期诊断、个性化管理和治疗。本综述旨在阐明实体器官移植术后EBV相关性PTLD的细胞、分子和遗传特征，并讨论其作为潜在生物标志物的可能性。

1 EBV的生命周期和免疫反应

1.1 EBV的生命周期

EBV通常通过唾液从被感染的个体传播到宿主，但在器官移植特别是儿童器官移植中，EBV可通过移植物进行传播，如受者EBV血清学阴性，但接受了EBV血清学阳性供者的器官。EBV感染后，首先进入裂解阶段，在口咽部复制，涉及上皮细胞和B细胞，并在产生新病毒子代时达到顶峰。病毒颗粒会脱落并继续感染其他细胞，或被传播到另一个宿主。在免疫功能正常的个体中，裂解阶段一般无症状，但青少年和年轻人可发生传染性单核细胞增多症（infectious mononucleosis，IM），通常为自限性。最终，EBV过渡到一个慢性的潜伏阶段，隐藏在宿主的记忆性B细胞中。EBV可以周期性地重新激活，可能是由感染细胞的B细胞受体的抗原接触所触发，但这一过程的确切机制仍不清楚。

1.2 EBV的免疫反应

个体感染EBV后，EBV囊膜上的gp350/220蛋白与B细胞上的CD21结合，通过细胞内吞作用进入B细胞，导致B细胞感染。这些EBV感染的B细胞可以表达潜伏膜蛋白（latent membrane proteins，LMP）和EBV核抗原，进而被宿主识别，通过CD8+细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）对其进行杀伤和清除[6]。这种细胞毒性效应可以减少EBV感染的B细胞数量，但是却不能将其彻底清除，因为EBV还能感染记忆性B细胞，并且表达的LMP1可以上调抗凋亡基因的表达，以及诱导B细胞进入潜伏感染状态，从而减少病毒抗原的表达，避免CTL的杀伤[6]。因此，EBV感染的B细胞与宿主的免疫系统处于动态平衡的状态。但对于接受免疫抑制治疗的实体器官移植受者，B细胞凋亡触发过程受到抑制，使得EBV诱发的B细胞增殖与免疫系统（增殖、凋亡）间的平衡被破坏，异常B细胞克隆性增生，导致PTLD。

另外，亦有文献报道T细胞与EBV的免疫应答有关[7]。病毒生命周期的每个阶段都与特定病毒蛋白的表达相关，这些病毒蛋白能够引发由T细胞（主要是CD8+T细胞）介导的细胞免疫反应，CD4+T细胞也发挥了一定的作用[8]。但受者感染EBV后，机体所发生的免疫应答过程，特别是继续发展为EBV相关性PTLD的过程，目前尚不清楚。在这个过程中，免疫抑制剂对T细胞功能的抑制被认为是EBV相关性PTLD发展的主要因素。

2 EBV监测的方法及临床意义

2.1 EBV监测的方法

EBV血清学检测通常用于评估病毒感染状态，并且可以针对EBV编码的潜伏周期蛋白特异性抗体[9]。然而，由于免疫状态的改变，移植受者血清学的变化更为复杂。因此，基于聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）直接定量EBV DNA的方法被广泛用于监测移植术后病毒载量，特别是在EBV阴性儿童受者接受来自EBV阳性供者的移植物中。虽然EBV相关性PTLD可以在移植术后的任何时候出现，但在移植术后1年内，即免疫抑制最强的时期，发生率最高，因此在这一时期监测最为重要。此外，PCR可用于EBV相关性PTLD出现症状时的EBV监测，也可用于监测EBV相关性PTLD的治疗反应。通常EBV DNA载量的阈值由各实验室确定，不利于跨中心比较。世界卫生组织对于EBV国际标准的制定将有助于各中心基于PCR的EBV DNA定量的协调统一[10]。然而，目前尚不清楚哪种方式对病毒定量分析最有效。大多数研究采用全血或血浆，但也有少量研究利用血清、外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）或分离的B细胞来评估EBV DNA载量。有研究发现在不同器官样本中，EBV DNA载量阈值、使用的检测量有显著差异[11]。因此，当早期诊断PTLD时，评估这些信息对于监测EBV DNA载量具有重要意义。

2.2 EBV监测的临床意义

由于EBV相关性PTLD的临床表现多样，缺乏特异性，而EBV DNA载量与EBV相关性PTLD 的发生发展及演化过程变化相一致，实验室血清学检测EBV抗体灵敏度不高，因此，EBV特异性抗体可用于判断移植前供、受者EBV血清学状态，以评估PTLD的发生风险；而动态测定EBV DNA载量对于高危患者术后早期PTLD的诊断以及治疗具有重要的指导意义。

一项单中心研究提示，儿童肝移植术后PTLD患者的EBV DNA载量≥10 000 copies/mL是有临床意义的，EBV DNA载量=10 875 copies/mL可作为临界值，灵敏度为0.929，特异度为0.379，密切监测EBV DNA载量对儿童肝移植受者PTLD的早期诊断和正确治疗至关重要[12]。另一项单中心研究提示，儿童肾移植术后PTLD患者EBV DNA载量的最大峰值高于整体观察到的中位数（59 909 copies/mL）是非早期病变PTLD和所有PTLD发病的独立危险因素，高EBV DNA载量与PTLD的发生有关[13]。

3 EBV相关性PTLD的生物标志物

美国国立卫生研究所于2001年将生物标志物定义为一种能客观测量并评价正常生物过程、病理过程或对药物干预反应的指示物[14]。生物标志物的发现、验证和可重复性测试是一个严格的、多步骤的过程，必须应用各种统计测试来建立[15]。虽然目前已有关于EBV相关性PTLD肿瘤标本的研究，但还没有确定的用于EBV相关性PTLD的生物标志物。

3.1 病毒核酸和蛋白质

组织中病毒核酸和蛋白质检测可用于确定组织中EBV的存在。Epstein-Barr编码区（Epstein-Barr encoding region，EBER）的原位杂交是检测组织切片中EBV的标准方法。EBER检测可用于提示潜伏性EBV感染，并有助于将病毒定位于病变内的特定细胞类型。LMP1是一种EBV编码的潜伏周期蛋白，可通过免疫组织化学染色鉴别组织标本中EBV感染的细胞。但也有专家认为，鉴于抗LMP1抗体在肿瘤中的表达具有潜在可变性，所以该方法的可靠性有待证实[16]。

微小核糖核酸（micro RNA，miRNA，miR）是一种微小非编码RNA，在基因转录后调控中起重要作用，且在血液中稳定表达，已成为生物标志物方面的研究热点。研究表明，EBV是第一个被发现可以编码miRNA的病毒[17]。尽管关于EBV miRNA在B细胞转化和增殖过程中作用的研究众多，但涉及其作为EBV相关性PTLD生物标志物的研究相对较少。Hassan等[18]检测了42例儿童肾移植受者BART和BHRF病毒开放阅读框的EBV miRNA，发现几个衍生的miRNA，包括BART7-3p、15、9-3p、1-3p和3-3p仅在经典的霍奇金淋巴瘤和IM受者中检测到。Navari等[19]发现，miRNA在肿瘤组织中的表达主要是细胞起源的，EBV miRNA的表达因EBV相关性PTLD的异质性而不同，如与EBV相关性Burkitt淋巴瘤组织不同，弥漫性大B细胞淋巴瘤型PTLD中能检测到EBV miR-BHRF-1-2。Zimmermann等[20]发现大多数EBV相关性PTLD标本中存在BART编码和BHRF1编码的miRNA，但不同类型的PTLD中miRNA表达不同。

EBV不仅可编码自身miRNA，也可以调节其感染的宿主细胞miRNA。Sang等[21]的研究表明，EBV在人B细胞中潜伏感染的建立显著改变了宿主细胞miRNA的表达。已有研究证实，miR-155可加速B细胞恶性肿瘤的发展[22]，miR-194参与白细胞介素（interleukin，IL）-10的调节[23]。近期研究证明，EBV感染的细胞可以释放含有miRNA的外泌体到细胞外环境，这表明外泌体可能是血液中EBV相关miRNA的来源[24]。EBV感染B细胞来源的miRNA，在EBV相关恶性肿瘤（如鼻咽癌）中具有作为生物标志物的潜力[25]。

Evens等[26]对PTLD受者、非PTLD受者和EBV血症的非移植受试者血液中裂解周期基因BZLF1和潜伏周期基因LMP2A的表达进行了分析，结果表明PTLD和非PTLD受者LMP2A/BZLF1比值差异无统计学意义，但均低于EBV血症的非移植受试者。Habib等[27]对35例PTLD受者的血清进行检测发现，60%的PTLD受者检测到可溶性EBV BZLF1基因的产物ZEBRA蛋白，且早发PTLD受者ZEBRA蛋白水平明显高于晚发PTLD受者。

研究表明潜伏期基因EBNA3c、LMP1和LMP2A/B以及溶解期相关基因gp350在PTLD心脏移植受者血液中的表达是可变的，具有溶解期和潜伏期的混合模式[28]。最常见的特征是潜伏期3和溶解期混合活动，可在病毒水平升高的未发病受试者（病毒携带者）中观察到，但PTLD受者中尚未发现[29]。

以上研究表明单纯的病毒基因表达与EBV相关性PTLD的发生无关。因此，需要更多的研究来确定病毒基因表达是否可以用来预测EBV相关性PTLD的症状和发病情况。一项针对儿童移植受者的多中心前瞻性临床研究正在进行，主要评估LMP1中两个功能增益突变的存在是否与EBV相关性PTLD风险增加有关[30]。可预见地说，下一代测序方法可能有助于识别与EBV相关性PTLD发展相关的病毒基因组变异和（或）突变，并可能产生新的候选生物标志物。

3.2 基因多态性和人类白细胞抗原

细胞因子在介导和调节病毒和肿瘤细胞免疫应答中起着重要作用，而单核苷酸多态性与细胞因子水平相关。有研究检测了移植受者细胞因子基因多态性，以确定特定细胞因子水平与EBV相关性PTLD的关系。虽然研究者发现二者存在一定的关联，但同时存在一些非确定性或相互矛盾的结果，导致细胞因子基因多态性作为预测EBV相关性PTLD风险的潜在生物标志物尚未达成共识。

T细胞和自然杀伤细胞产生的干扰素（interferon，IFN）-γ在抗病毒应答中非常重要，低水平IFN-γ与EBV相关性PTLD的早期发病有关[31]。Toyoda等[32]和Lee等[33]在PTLD受者中发现IL-10和转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β低基因型之间存在关联。此外，McAulay等[34]报道，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α启动子内的一种特定变异等位基因在EBV相关性PTLD受者中更为常见，而淋巴毒素、IL-1α、IL-6、IL-10、TNF受体Ⅰ或Ⅱ、IL-1受体和IL-10受体的多态区域中未见差异。因此，目前还没有明确的某一个细胞因子基因多态性或某一组基因多态性提示EBV相关性PTLD发生风险的增加。

研究发现，移植受者的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）可能会影响EBV免疫应答的程度，这是由于EBV衍生肽的抗原提呈和病毒效应细胞识别的不同，供者或受者HLA不同亚型与EBV相关性PTLD易感性有关[35]。

3.3 其他可能对PTLD诊断有帮助的病毒

德国Quake实验室检测了96例心脏移植和肺移植受者血浆游离循环DNA中的人类病毒，并分析了免疫抑制和抗病毒预防对病毒水平的影响，结果发现特定的病毒与不同水平的药物治疗相关[22]。当免疫抑制和抗病毒药物水平较低时，患者血浆疱疹病毒和有尾噬菌体的载量较高，反之则以指环病毒为主，活组织检查证实发生排斥反应的受者其细环病毒载量显著低于无排斥反应的受者[22]。在高水平的指环病毒提示过度免疫抑制的情况下，指环病毒载量可能是体现免疫能力的替代标志物。另有研究对PTLD受者石蜡包埋淋巴瘤组织的鸟枪法宏基因组测序结果显示，50%以上PTLD受者的标本含有指环病毒序列，单因素变量分析显示指环病毒水平（而非EBV水平）与受者5年内死亡有关[35]。这些发现表明，病毒组的变化，甚至是特定的病毒组分变化如指环病毒，可间接提示免疫抑制水平和免疫状态，同时影响EBV相关性PTLD的疾病发展。

4 EBV阴性PTLD的病因及PTLD预后情况

部分PTLD受者表现为EBV阴性，且近年来有增加趋势，但病因不明。因此，诊断PTLD并不一定要依靠EBV监测。EBV阴性PTLD在发病机制不同于EBV相关性PTLD，而是与EBV阴性的恶性淋巴瘤类似。EBV阴性PTLD只是恰巧发生于免疫抑制状态下，而不是真正的EBV相关性PTLD。不考虑EBV相关与否，目前PTLD受者总体预后较差，总病死率为25%～60%，治疗手段的进步可提高PTLD受者的总体生存率[36]。已有研究表明，降低免疫抑制水平可以使疾病消退，在没有排斥反应的情况下，可取得较好的治疗效果，尤其是儿童受者。同时，PTLD的不良预后相关因素已有报道，高水平的乳酸脱氢酶、低蛋白血症、中枢神经系统受累及高龄等与不良预后相关[37]。

5 小 结

综上所述，EBV相关性PTLD的诊断和治疗仍然是临床一大挑战，寻找非侵入性、特异性和敏感性的生物标志物指导临床诊断和治疗具有重要意义。目前，生物标志物的焦点主要集中于可以在血液中检测到的病毒核酸、蛋白质和HLA。已有研究发现了一些很有潜力的候选分子，但在识别作为EBV相关性PTLD发生、诊断和治疗反应的特定风险指标的生物标志物等方面仍存在重大挑战，未来基于综合分析候选分子和测量病毒载量，可能会获得更好的分析结果。此外，目前大多数研究都是在样本量较少的成年受试者中进行的，因此，建立以儿童受者为研究对象的队列研究，对于探索和验证高灵敏度生物标志物是十分重要的。