PCR荧光探针法联合DNA微阵列芯片法检测在肺结核诊断和治疗中的应用

王晓红

江西省上饶市第二人民医院检验科，江西上饶 334000

肺结核是临床呼吸内科常见的一类慢性传染性疾病，主要是由于结核分枝杆菌感染肺部而引起，主要症状包括发热、咳痰、疲乏无力、血液系统异常等，此病亦是中青年人群的重要死因之一，对患者的生命健康造成严重威胁[1-2]。目前对于肺结核的诊断，多采用医生询问体征及有无病史结合痰结核分枝杆菌检查，以及影像学检查等[3]。肺结核发病率居高不下，引起国内外广泛关注，以往通过传统痰涂片痰培养诊断肺结核，但此种方法存在检测阳性率低，所需时间长等不足之处，为临床诊治带来了难度，因此提高肺结核的诊断阳性率以及诊治速度尤为关键[4-5]。本研究主要探究PCR荧光探针法联合DNA微阵列芯片法检测在肺结核诊断和治疗中的应用效果，旨在寻找临床诊断肺结核及耐药鉴定快速准确的实验指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年1月至10月上饶市第二人民医院收治的128例肺结核患者为观察组，另外选取同期40例非肺结核患者为对照组。对照组中，男30例，女10 例；年龄 24～80 岁，平均（52.15±5.02）岁。观察组中，男 96例，女 32例；年龄 23～81岁，平均（54.05±4.85）岁。两组的一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经上饶市第二人民医院医学伦理委员会批准。纳入标准：①观察组患者经临床诊断并结合影像学资料、实验室检查，确诊为肺结核患者；②所有对象均留取晨痰、血清标本进行痰涂片抗酸染色结核抗体PCR荧光探针法及DNA微阵列芯片法检测；③患者及其家属知晓本次研究，并签署知情同意书。排除标准：①患有恶性肿瘤者；②合并心、肝、肾等重要器官功能障碍者；③合并患有其他传染疾病者。

1.2 检测方法

（1）痰涂片抗酸染色法：取痰液标本涂在载玻片上，使用抗酸染色液（珠海贝索生物技术有限公司，生产批号：20191021）进行染色，染色完成后置于显微镜下观察，连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌为抗酸杆菌阴性（－），否则为抗酸杆菌阳性（＋）。（2）PCR荧光探针法：①收集患者痰液标本，加入等量4%NaOH溶液于离心管中震荡摇匀，室温下液化30 min后放入离心机（1200 r/min）中离心5 min，弃上清液后加入1 ml生理盐水后离心，重复以上操作，弃上清液后加入核酸提取液50 μl，混匀后放入DNA提取仪震荡5 min，取出放在95℃水浴锅中加热5 min；将提取好的核酸加入反应体系中，进行PCR扩增程序，分别为37℃，30 s；94℃，180 s；94℃，15 s；60℃，30 s； 检测时选择FAM、VIC通道，采集荧光点在60℃，30 s。当Ct值＜40为阳性，扩增曲线非S型或者Ct值为40（或者无数值）则为阴性[6]。（3）结核抗体检测：采用结核抗体检测试剂盒（上海奥普生物医药股份有限公司，生产批号：20190915）进行检测，在反应板的反应孔中间，依次加入2滴封闭液、40 μl血清标本、6滴洗涤液、2滴金标液、6滴洗涤液，等待薄膜吸入。结果读取：薄膜中间有红圆点为阳性，否则为阴性。（4）DNA微阵列芯片法：对PCR扩增出结核分枝杆菌的提取液和结核基因芯片反应液进行扩增，扩增产物进行芯片杂交，之后采用结核分枝杆菌耐药基因盒（成都博奥晶芯生物科技有限公司，生产批号：20191102）进行利福平和异烟肼耐药性检测[7]，洗板使用微阵列扫描仪和相应软件进行信号的读取及结果判读，所有操作过程都严格按照说明书执行。

1.3 观察指标及评价标准

①比较痰涂片抗酸染色、血清结核抗体及PCR荧光探针法检测结果及诊断效能，a、b、c、d分别表示真阳性、假阳性、假阴性、真阴性，灵敏度=a/（a+c），特异度=d/（b+d），阳性预测值=a/（a+b），阴性预测值=d（c+d），准确度=（a+d）/（a+b+c+d）。②统计 DNA 微阵列芯片法检测利福平和异烟肼耐药性结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 痰涂片抗酸染色、血清结核抗体及PCR荧光探针法检测结果及诊断效能比较

PCR荧光探针法诊断肺结核的灵敏度、特异度、阳性预测值、准确度高于痰涂片抗酸染色和血清结核抗体，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 1～4）。

表1 痰涂片抗酸染色检测结果（例）

表2 血清结核抗体检测结果（例）

表3 PCR荧光探针法检测结果（例）

表4 三种检测方法检测诊断效能比较（%）

2.2 DNA微阵列芯片法检测利福平和异烟肼耐药性的结果

128例肺结核患者中，DNA微阵列芯片法检出利福平敏感45例，耐药11例；异烟肼敏感44例，耐药12例；双重耐药5例。其中11例利福平耐药标本中，利福平rpoB基因耐药位点分布为531（TCG→TTG）位点 6例，526 （CAC→TAC） 位点 2例，526 （CAC→CTC）位点 1 例，516（GAC→GGC）位点 1 例，511（CTG→CCG）位点1例；12例异烟肼耐药标本中异烟肼katG基因耐药位点分布为315（AGC→ACC）位点11例，315（AGC→AAC）位点 1 例。

3 讨论

肺结核是严重威胁公共卫生安全的传染病之一，兼具感染率高、死亡率高、控制进程缓慢等特点，因此早期诊断及尽早制定治疗方案对治疗肺结核尤为重要[8]。肺结核是由结核分枝杆菌所引起，因此目前临床上对于发现结核病传染源的主要手段是对患者痰液中的结核分枝杆菌进行检测，常用方法有改良罗氏法、结合抗体检测等，但这些方法在检测阳性率、检测周期等方法存在不足之处[9-10]。近些年来，由于分子生物技术的快速发展，相关检测技术应用于肺结核临床诊断中，PCR荧光探针具有检测周期短、敏感度高等优势，可精准检测患者痰液中的结核分枝杆菌；DNA微阵列芯片法操作简单且可以同时检测多种分枝杆菌多种耐药情况，可有效减少患者诊断和治疗时间[11-12]。

PCR荧光探针法诊断肺结核的灵敏度、特异度、阳性预测值、准确度高于痰涂片抗酸染色和血清结核抗体，差异有统计学意义（P＜0.05），提示PCR荧光探针法可作为临床分枝杆菌感染诊断的重要检测手段。PCR荧光探针法主要是将双重PCR技术和Taqman探针技术相结合，再根据结核分枝杆菌的特异性序列，设计引物以及探针；探针标记不同的荧光发光基因，根据不同的荧光通道的荧光信号变化，判定是否感染结核分枝杆菌，操作简便、快速，且准确率高[13]。本研究结果显示，实验组应用DNA微阵列芯片法检出利福平敏感45例，耐药11例；异烟肼敏感44例，耐药12例；双重耐药5例，提示DNA微阵列芯片法可快速检测结核分枝杆菌对利福平异烟肼耐的耐药性，具有较高的检测效能。DNA微阵列芯片法是通过检测抗结核药物利福平和异烟肼的耐药基因的野生型、不同突变型来判断是否耐药；同时可快速检测标本中的分枝杆菌利福平基因和耐异烟肼基因突变的变位点，特异性高[14-15]；此外设计PCR扩增引物与核苷酸探针，在芯片上固定，并经与针对性扩增受检样本的DNA片段杂交，通过芯片扫描仪对杂交后的芯片荧光信号进行扫描获取菌种信息[16-17]。DNA微阵列芯片法检测结核分枝杆菌的耐药与传统药物敏感法有较高的一致性，较为可靠且检测所需时间短，可以作为临床肺结核耐药性的快速筛查方法[12]。

综上所述，PCR荧光探针法联合DNA微阵列芯片法既能提高结核分枝杆菌的阳性率，也能快速检测结核分枝杆菌的耐药性，48 h即可获得诊断及耐药结果，可以协助早期诊断，制定有效的治疗方案，对改善肺结核患者预后具有重要意义，临床价值高。