miR-27a、miR-138-5p 对食管癌患者术后生存情况的预测作用及与复发转移的关系

周阳 王聪 付民 尹星 常欢 邢艳丽 李毅星 高新雅 王晶

南阳市第二人民医院肿瘤科（河南南阳 473000）

食管癌为常见的消化道肿瘤，其发生与饮食习惯、遗传、环境等因素有关。因缺乏可靠的早期诊断方法，食管癌患者初诊多为中晚期，预后较差［1］。目前，一些肿瘤标志物如癌胚抗原等开始用于癌症早期诊断中，但对食管癌的特异度、敏感度不高，无法满足诊断需求，迫切需要探寻新的分子标志物。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类非编码小RNA，与肿瘤发生发展存在密切关系，且稳定性极强，不但能辅助肿瘤诊断，还可预测患者预后［2］。据报道［3］，miRNA 往往在恶性肿瘤中表达异常，在肿瘤发生发展过程中发挥癌基因或抑癌基因的作用。miR-27a、miR-138-5p 是分别在多种恶性肿瘤中表达异常的miRNA，作为肿瘤筛查标志物中有一定潜力。MAGHSUDLU 等［4］报道，miR-27a 在食管鳞状细胞癌中表达上调。WANG 等［5］表明，miR-138-5p 在人类大肠癌中充当肿瘤抑制因子。但miR-27a、miR-138-5p 作为食管癌筛查标志物的鲜有报道。故本研究通过荧光定量PCR 法检测血清miR-27a、miR-138-5p 表达水平，探讨其对食管癌的诊断、术后生存预测以及与患者术后复发转移相关性，并为食管癌诊断和预后评估提供新的方法。

1 资料与方法

1.1 病例资料本研究纳入医院收治的食管癌患者70 例、慢性食管炎患者230 例、健康体检者70 例为研究对象，分别设为食管癌组、食管炎组、健康组。

纳入标准：（1）食管癌组经术后病理学检查确诊为食管癌；食管炎组经食管造影、内镜、病理检查等排除食管癌可能性，确诊为慢性食管炎；健康体检者经查体显示无恶化器质性病变，健康状态良好。（2）临床病理资料完整。（3）神智、沟通能力正常，签订了知情同意书。（4）主动配合随访、复查。

排除标准：（1）食管癌患者非病理初次确诊，或术前接受过免疫治疗、抗肿瘤治疗等干预。（2）术后3 个月死亡。（3）既往有其他消化道系统疾病。（4）合并严重精神病、酒精或药物滥用史等。三组患者年龄、性别、体质量指数等一般资料比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 三组患者一般资料比较Tab.1 Comparison of general information of three groups of patients

表1 三组患者一般资料比较Tab.1 Comparison of general information of three groups of patients

1.2 方法

1.2.1 血清miR-27a、miR-138-5p 检测在三组研究对象入院当天，采集清晨空腹静脉血3 mL，1 500 r/min 离心15 min，离心半径6 cm，取上清液，保存在-80 ℃冰箱，标本避免反复冻融、溶血。取血清标本，用miRNeasy Mini Kit 试剂盒（北京华夏远洋科技有限公司）提取miRNA，参考说明书进行。取2 μL 总RNA，用TaqMan miRNA 逆转录试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）将其反转录为cDNA，用定量即时聚合酶链反应法（QRT-PCR）检测三组受检者的血清miR-27a、miR-138-5p 表达水平。miR-27a、miR-138-5p 及其内参U6 引物由吉凯基因化学技术有限公司合成，引物序列见表2。PCR 反应体系为20 μL，包括1.2 μL 氯化镁、10×PCR buffer、0.4 μL 脱氧核糖核苷三磷酸、0.5 μL 上下引物、0.4 μL Taq 酶、1 μL 模板cDNA、14 μL 无RNA 酶双蒸水。PCR 循环参数：94 ℃5 min，94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃40 s，40 个循环。用2-△△CT法计算miR-27a、miR-138-5p mRNA 相对表达量。

表2 miR-27a、miR-138-5p、U6 引物序列Tab.2 Primer sequences of mir-27a，mir-138-5p and U6

1.2.2 研究方法（1）比较三组受试者血清miR-27a、miR-138-5p 表达水平差异。（2）随访3 年，统计食管癌患者复发转移情况，并分为复发转移组、无复发转移组，收集两组患者资料，包括年龄、性别、体质量指数（body mass index，BMI）、吸烟、饮酒、肿瘤直径、分化程度、术后化疗、术后放疗、病理分期、手术根治程度、切缘阳性、淋巴结转移、血清miR-27a 及miR-138-5p 表达水平。对上述可能导致术后复发转移的因素赋值，以其为自变量，以是否发生术后复发转移（否=0，是=1）为因变量，logistic 回归分析食管癌患者血清miR-27a、miR-138-5p 表达与术后复发转移的相关性。见表3。（3）随访3 年，根据患者术后生存情况分为存活组、死亡组，比较组间血清miR-27a、miR-138-5p 表达水平差异。（4）采用ROC 曲线评估血清miR-27a、miR-138-5p 对食管癌患者术后生存情况的预测价值。

表3 Logistic 回归分析赋值Tab.3 Logistic regression analysis

1.3 统计学方法采用SPSS 26.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示，多组比较用单因素方差分析，两组比较用独立样本t检验。计数资料以例（%）表示，进行χ2检验。等级资料采取秩和检验。用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）曲线及曲线下面积（Area under Curve，AUC）分析血清miR-27a、miR-138-5p 表达水平对食管癌的诊断效能及对患者术后生存情况的预测作用。单因素及logistic 回归分析食管癌患者血清miR-27a、miR-138-5p 表达与术后复发转移的相关性。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 食管癌组、食管炎组、健康组血清miR-27a、miR-138-5p 表达水平三组血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相对表达量组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。食管癌组血清miR-27a mRNA 相对表达量高于食管炎组、健康组，食管炎组血清miR-27a mRNA 相对表达量高于健康组（P＜0.05）；食管癌组血清miR-138-5p mRNA 相对表达量低于食管炎组、健康组，食管炎组血清miR-138-5p mRNA 相对表达量低于健康组（P＜0.05）。见表4。

表4 三组血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相对表达量比较Tab.4 Comparison of the relative expression levels of serum mir-27a and mir-138-5p mRNA among the three groups

表4 三组血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相对表达量比较Tab.4 Comparison of the relative expression levels of serum mir-27a and mir-138-5p mRNA among the three groups

注：与食管癌组比较，*P＜0.05；与食管炎组比较，#P＜0.05

2.2 食管癌术后复发转移组、无复发转移组的病理参数比较经单因素分析发现，复发转移组、无复发转移组的病理分期、手术根治程度和血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相对表达量组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），其余病理参数比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表5 食管癌术后复发转移组、无复发转移组的病理参数比较Tab.5 Comparison of pathological parameters between postoperative recurrence and metastasis group and non recurrence and metastasis group of esophageal cancer 例（%）

2.3 logistic 回归分析食管癌术后复发转移的影响因素病理分期Ⅱ-Ⅲ期、姑息性切除术和血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相对表达量升高均为影响食管癌术后复发转移的独立危险因素（P＜0.05）。见表6。

表6 食管癌术后复发转移的多因素分析结果Tab.6 Multivariate analysis of recurrence and metastasis of esophageal cancer

2.4 存活组、死亡组血清miR-27a、miR-138-5p 表达水平存活组血清miR-27a mRNA 相对表达量低于死亡组，血清miR-138-5p mRNA 相对表达量高于死亡组（P＜0.05）。见表7。

表7 存活组、死亡组血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相对表达量Tab.7 Relative expression levels of serum mir-27a and mir-138-5p mRNA in survival group and death group

表7 存活组、死亡组血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相对表达量Tab.7 Relative expression levels of serum mir-27a and mir-138-5p mRNA in survival group and death group

2.5 血清miR-27a、miR-138-5p 对食管癌患者术后生存情况的预测价值ROC 结果显示：血清miR-27a、miR-138-5p 预测食管癌术后生存情况的最佳截断点分别为1.42、0.26，单独及联合预测食管癌术后生存情况的AUC 分别为0.773、0.731、0.829。见表8、图1。

表8 血清miR-27a、miR-138-5p 单独及联合检测对食管癌患者术后生存情况预测价值Tab.8 The predictive value of serum mir-27a and mir-138-5p for postoperative survival of patients with esophageal cancer

图1 血清miR-27a、miR-138-5p 对食管癌患者术后生存情况预测作用的ROC 曲线图Fig.1 ROC curve of serum mir-27a and mir-138-5p in predicting survival of patients with esophageal cancer

3 讨论

我国是食管癌高发地区，且发病情况存在地域性差异，部分地域发生率极高［6］。目前中晚期食管癌仍以手术结合放化疗为主，治疗结局不理想，但早期食管癌患者预后相对良好，因此早期诊断、有效防治是目前应对食管癌的最优选择［7］。当前多种miRNA被作为肿瘤早期诊断、靶向治疗的靶点。张兵等［8］报道miRNA 在人类基因组中的比例不高，但能调控人类30%以上的基因表达，在人类疾病特别是恶性肿瘤的生物学行为过程中扮演重要角色。

miRNA 有组织及细胞特异性、高度保守性、时序性，决定了其在不同恶性肿瘤中的表达情况不同［9-11］。miR-27a、miR-138-5p 作为有潜力的分子标志物，参与多种肿瘤生长、分化、转移、耐药等过程。LI 等［12］认为miR-27a是肿瘤中的新型生物标志物和潜在的治疗靶标。WANG 等［13］研究证明，miR-27a 在食管癌中呈上调表达，可通过干扰其表达水平增强放射敏感性。FRIEDRICH 等［14］认为miR-27a-3p可通过调节转录因子cAMP反应元件结合蛋白影响食管鳞状细胞癌细胞的增殖、凋亡、转移等生物学行为。GAO 等［15］经荟萃分析证明miR-138表达水平是预测食管癌的潜在预后指标；ZHENG等［16］研究发现miR-138的下调预示了食管鳞状细胞癌患者的预后不良。本研究结果显示：从食管癌组到食管炎组、健康组，血清miR-27a 表达逐渐下调，miR-138-5p 表达逐渐上调，提示食管癌患者血清miR-27a表达异常上调、miR-138-5p表达异常下调，与上述研究结果一致，且提示血清miR-27a、miR-138-5p检测可用于鉴别食管癌。本研究中，病理分期、手术根治程度、血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相对表达量均为影响食管癌术后复发转移的独立因素，提示除病理分期、手术根治程度两项常规因素外，血清miR-27a、miR-138-5p 表达与食管癌患者术后复发转移密切相关，可能与miR-27a、miR-138-5p 全程参与食管癌发生发展过程有关。CUI 等［17］表明，miR-27a 不但可用于肿瘤早期诊断中，其表达水平与肿瘤分级、患者生存时间相关；LANCA等［18］报道，miR-138可作为非肌肉浸润性膀胱癌患者预后生物标志物。本研究中，存活组血清miR-27a mRNA相对表达量低于死亡组，血清miR-138-5p mRNA相对表达量高于死亡组，提示其表达水平与患者预后相关，进一步绘制ROC曲线提示二者可准确预测患者术后生存情况，且联合预测的灵敏度、特异度、准确度更高。

本研究存在样本量小、随访时间短等缺陷，未来研究需增加病例数，延长随访时间，便于全面评估血清miR-27a、miR-138-5p 对食管癌患者术后复发转移的影响及对生存情况的预测价值，为食管癌治疗及预后预测提供新的方法。

综上所述，血清miR-27a、miR-138-5p 表达水平与食管癌患者术后复发转移相关，可作为诊断食管癌的辅助手段，还可用于预测患者术后生存情况。未来应进一步排除相关影响因素，阐述血清miR-27a、miR-138-5p 对食管癌预后的预测价值。