经自然腔道取标本的腹腔镜结直肠癌手术对于细菌污染及脱落肿瘤细胞播散种植的影响

卜君 李念 何山 原红军 邓亨怡 陈琼 伍晓汀

成都市第二人民医院普通外科（成都 610041）

如何从生理微创迈向生理和心理双重微创，实现腹壁无瘢痕化，一直是腹部外科医生努力的方向。2007 年，MARESCAUX 等［1］为1 例30 岁的女性胆囊结石患者施行经阴道内镜胆囊切除术，术后体表无瘢痕，被公认为世界首例成功应用于人体的自然腔道内镜手术（natural orifice transluminal endoscopic surgery，NOTES）。NOTES 不仅消除了腹壁切口感染问题，减少了术后疼痛，降低了切口疝的风险，还使患者术后恢复增快，对追求美容效果的患者具有极大的吸引力［2-3］。但是，目前NOTES 仍存在入路的安全建立与闭合以及特殊手术器械需求等制约因素，影响其临床推广［4］。在这种情况下，经自然腔道取标本（natural orifice specimen extraction，NOSE）手术，以美容效果好且不需要特殊医疗器械的优点而引起人们的重视。

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）作为消化系统常见的恶性肿瘤，严重危及人们的健康。为了提高治疗效果，结合NOSE 技术的腹腔镜结直肠癌手术成为临床研究的热点之一［5-6］。目前这些研究中，前瞻性的随机对照实验（randomized controlled trial，RCT）较少，特别是研究手术过程手术区域细菌污染情况以及肿瘤细胞种植播散的研究极少［7］。本研究主要分析应用NOSE 技术对于腹腔镜结直肠癌手术患者术区污染及肿瘤种植播散的影响，探讨该类手术的过程中避免腹盆腔污染及肿瘤种植转移的措施。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2013 年9 月至2015 年2 月住院符合纳入条件的结直肠癌患者共92 例（由于国际研究［8-9］中腹腔脱落细胞肿瘤阳性率的差别较大，故选择腹盆腔感染率来预估样本量，根据查阅文献并结合我院预实验数据［10-12］，预估失访率为15%，以此计算样本量），采用随机数字表法分为两组各46 例，分别为传统腹腔镜组（L 组），应用NOSE 技术的腹腔镜组（NL 组）。该研究经过医院伦理委员会（institutional review board，IRB）审核并批准。由于开放手术和传统腹腔镜手术的比较研究已经较多［13-17］，为了节约资源，本研究对照组未设定开放手术组。

1.2 纳入与排除标准［18］

1.2.1 纳入标准（1）术前病理学确诊为结直肠癌；（2）术前TNM分期Ⅰ～Ⅲ期（UICC/AJCC 2013）；（3）术前评估肿瘤直径≤3 cm，距离肛门≥6 cm；（4）年龄≥18 岁且≤81 岁；（5）非急诊手术；（6）术前未接受化放疗；（7）术前无完全性肠梗阻和肠穿孔；（8）术前无胃肠道手术史；（9）术前根据美国麻醉医师协会（American Society of Anesthesiology，ASA）标准麻醉和手术耐受力评估为Ⅰ～Ⅲ级；（10）术前签署知情同意书。

1.2.2 排除标准（1）合并严重的心、肺、脑血管疾病或合并其他严重器官功能障碍者；（2）合并其他恶性肿瘤者；（3）合并严重的自身免疫系统疾病者；（4）术前存在肛门狭窄者；（5）体质量指数（body mass index，BMI）≥30 kg/m2者；（6）术前长期接受糖皮质激素治疗者；（7）术前合并尚未控制的精神疾病患者；（8）术前合并非特异性肠炎者；（9）妊娠或哺乳期妇女；（10）无存活希望、临终或不可逆昏迷患者。

1.3 方法

1.3.1 手术原则所有手术遵循肿瘤的根治原则，且均由同一医生团队完成。手术过程中，若发现肿瘤无法经腹腔镜切除，则及时中转开腹手术［19］。对于尺寸较小的病灶，采用术中肠镜定位。

1.3.2 术前准备所有患者围手术期处理原则相同，规范使用抗生素。术前常规控制可能影响手术的内科系统疾病，改善患者营养状态，行适当的肠道准备。

1.3.3 手术方式［18，20］手术操作采用五孔法，在取手术标本之前，两组患者的手术步骤相同，主要区别在于手术标本的取出方法。NL 组取标本操作：腹腔镜下，对于结肠肿瘤，在距离肿瘤根治性手术要求切断处，使用切割闭合器分别予以切断闭合。切除部分包括肿瘤、肠系膜和足够长度肠管。将标本中网膜组织与结肠切开分离。而对于直肠肿瘤，仅在距离肿瘤根治性手术要求切断的肿瘤远端处，使用切割闭合器予以切断闭合。另切取少许网膜脂肪组织，经12 mm 穿刺口取出后，无菌下切碎压榨形成油状脂肪，外涂于无菌保护套（规格14×200 cm，两端有结扎带）外壁，然后将其经12 mm 穿刺口放入腹腔，将标本理顺成条状，放入保护套内并扎紧。经肛门置入肠镜或者卵圆钳（针对乙状结肠肿瘤和直肠肿瘤），到达结肠断端闭合处。使用超声刀切开该结肠或直肠断端，肠镜异物钳或者卵圆钳抓取结扎带，扩肛后缓慢从肛门脱出保护套及标本。NL 组吻合操作：对于结肠肿瘤，腹腔镜下，超声刀切开近端肠道闭合端，使用切割闭合器将远近端肠管行侧侧吻合，更换钉仓后再闭合两肠管残端。对于直肠肿瘤，体外直视下，距离肿瘤近端约10 cm 处离断标本，将圆形吻合器的抵钉座放入近端结肠并回纳腹腔，腹腔镜下，圆形吻合器经肛作端端吻合。

1.3.4 灌洗液检测所有患者均收集4 次灌洗液（0.9%氯化钠注射液500 mL 灌洗5 min 后收集）：（1）手术开始时，冲洗腹盆腔（非直接喷冲肿瘤）；（2）手术结束前，吸尽明显积液，冲洗腹盆腔；（3）吻合前，冲洗远端肠腔；（4）吻合后，冲洗吻合口及远端肠腔。灌洗液采用普通细胞学涂片的方法检测［21-23］，在高倍镜（400 ×）下发现癌细胞定为游离癌细胞阳性，没发现为阴性。肠腔灌洗液需先加入10%甲醛150 mL，过滤除去粪渣，静置2 h。

1.4 观察指标

1.4.1 一般资料收集患者性别、年龄、BMI、肿瘤部位、术前TNM 分期、术前非胃肠道腹部手术史、ASA 分级、淋巴结清扫数量、环周切缘阳性率、术后TNM 分期、术后化放疗率等资料。

1.4.2 感染性相关指标（1）手术开始时，腹盆腔灌洗液细菌培养结果；（2）手术结束前，腹盆腔灌洗液细菌培养结果；（3）术后全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）［24-25］发生率；（4）术后切口感染发生率。

1.4.3 肿瘤种植播散和复发相关指标（1）手术开始时腹盆腔灌洗液游离肿瘤细胞阳性率；（2）手术结束前腹盆腔灌洗液游离肿瘤细胞阳性率；（3）吻合前远端肠腔灌洗液游离肿瘤细胞阳性率；（4）吻合后吻合口及远端肠腔灌洗液游离肿瘤细胞阳性率；（5）随访期间无局部复发生存率（local relapsefree survival，LRFS），无区域淋巴结复发生存率（nodal relapse-free survival，NRFS）以及无远处转移生存率（distant metastasis-free survival，DMFS）。

1.5 统计学方法使用Excel 2007 软件建立数据库，采用SPSS 19.0 软件进行统计分析，采用Graph-Pad Prism 7.0 软件绘制生存曲线，遵循意向性处理原则（Intention-to-treat，ITT）。计量资料采用均数±标准差进行统计描述，正态分布和方差齐，采用t检验或方差分析比较差异；计数资料采用χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier 曲线描述，采用Log-rank 检验。所有统计检验均采用双侧检验，检验效能1-β=0.9（β=0.1），P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较本研究按照纳入和排除标准纳入患者92 例，其中男51 例，女41 例，年龄31～81 岁，平均68.5 岁。实施过程中，L 组有3 例患者和NL 组有2 例患者术中发现肿瘤存在远处转移，中转行开放手术。另外，NL 组2 例患者术中发现肿瘤较大，无法经肛取出，1 例患者在手术开始后不久，家属拒绝经肛取出标本，以上3 例均改为传统腹腔镜手术（随机研究流程图见图1）。术后，对于病理分期Ⅲ～Ⅳ期的44 例患者（L 组24 例，NL组20 例）推荐进行化放疗。两组患者的一般资料差异无统计学意义，具有可比性（均P＞0.05）。患者随访时间3～53 个月，平均39.9 个月。

图1 随机研究流程图Fig.1 Flow chart of randomized study

2.2 感染性相关指标及肿瘤种植播散比较两组患者，SIRS、切口感染发生率差异无统计学意义（均P＞0.05），手术开始时和结束前腹腔灌洗液细菌培养结果以及游离肿瘤细胞阳性率差异均无统计学意义（均P＞0.05），吻合前后肠腔灌洗液游离肿瘤细胞阳性率差异无统计学意义（均P＞0.05）。各自组内比较，手术开始时和结束前腹腔灌洗液细菌培养结果以及游离肿瘤细胞阳性率差异均有统计学意义（均P＜0.05），吻合前后肠腔灌洗液肿瘤细胞阳性率差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

表1 两组间感染指标和肿瘤细胞播散种植指标比较Tab.1 Comparison of infection-related indicators，indicators related to implantation and dissemination of tumor cells between the two groups

2.3 复发相关指标随访期间，L 组肿瘤复发8 例（其中肿瘤相关死亡5 例，带瘤生存3 例），其他原因死亡1 例，失访1 例；NL 组肿瘤复发7 例（其中肿瘤相关死亡4 例，带瘤生存3 例），其他原因死亡3 例，失访2 例。根据ITT 分析原则，两组患者间比较，其LRFS 和NRFS 以及DMFS 差异均无统计学意义（P=0.578，P=0.367，P=0.695，图2）。

图2 两组间生存曲线比较Fig.2 Comparison of survival curves between the two groups

3 讨论

1991 年JACOBS 等［26］首次报道了腹腔镜结直肠切除术，开创了胃肠道疾病微创外科的新时代。但传统腹腔镜手术在取出切除的病变组织时，需要在腹壁开一长约4～5 cm 的切口，可能出现切口感染等并发症，亦存在美容效果不足的遗憾。而为解决该问题的NOTES 技术目前同样存在诸多困难［4］。2008 年PALANIVELU 等［27］提出了系统的NOSE 概念，将其推荐为向NOTES 过渡的桥梁技术。本研究显示，应用NOSE 技术的腹腔镜结直肠癌手术与传统腹腔镜手术比较，患者在手术区域细菌污染和脱落肿瘤细胞播散种植方面无明显差异。

本研究在确定研究对象时，特别注意完善术前2 周内的肠镜、CT 或者MRI 等检查，避免由于该类检查与手术时间间隔较久，而影响对肿瘤大小和肿瘤分期的判断。这样，既符合经肛门取标本时对于肠管直径大小和肠管副损伤的考虑，也尽力回避较高的中转开放率。术后结果显示，NL 组仅有2 例患者，术中发现肿瘤直径过大，无法经肛门取出，改为传统腹腔镜手术。研究表明，肿瘤直径≤3 cm 和肿瘤的较早分期对于NOSE 技术的顺利应用是最为重要的因素，这与其他类似研究［7，28］是基本一致的。

感染性指标方面，两组患者间SIRS 发生率、切口感染发生率以及手术不同时间节点的腹腔灌洗液细菌培养结果差异均无统计学意义（均P＞0.05）。而两组患者各自组内比较，手术开始时、结束前腹腔灌洗液细菌培养结果差异均有统计学意义（均P＜0.05）。由于原发性和继发性感染因素，人体腹盆腔内本身就存在一定数量的细菌。在手术过程中，即使术前经过肠道准备，NOSE 手术方式理论上仍然会增加细菌污染概率。但是，本研究及其他类似研究表明［29-34］，NOSE 手术并没有增加SIRS 和切口感染等感染性并发症的发生风险。术前充分肠道准备，术中严格坚持无菌化原则，行必要的腹腔和肠腔冲洗，NOSE 手术可以达到和传统腹腔镜手术一致的细菌感染率。

肿瘤种植播散和复发性指标方面，两组患者腹盆腔灌洗液游离肿瘤细胞阳性率在手术开始时、结束前以及肠腔灌洗液游离肿瘤细胞阳性率在吻合前、吻合后的差异比较均无统计学意义（均P＞0.05）。另外，两组患者各自组内比较，仅腹盆腔灌洗液肿瘤细胞阳性率在手术开始时与结束前的差异（L 组0%vs.13.04%，NL 组4.35%vs.21.74%）有统计学意义（均P＜0.05）。正如本研究在确定样本量时，检索文献发现不同的研究中肿瘤细胞阳性率差别较大一致。本研究中腹盆腔和肠腔灌洗液中肿瘤细胞阳性率与其他研究结果存在一定的差异［7-8］，这可能与样本量大小差异和肿瘤脱落细胞的检查方法差异有关。结直肠癌根治术后局部复发有多种原因，可能与已经转移的淋巴结清扫遗漏、游离肿瘤细胞在腹盆腔的残留和种植、相应结直肠系膜组织清扫遗漏、肠腔吻合口的脱落肿瘤细胞种植等多种原因有关。本研究结果提示，尽管理论上腹腔镜手术操作较开放手术轻柔，但是实际上仍然存在术中肿瘤细胞脱落情况，特别是应用NOSE 技术过程中需要经过肠道和肛门。需要指出的是，肿瘤细胞脱落直至局部种植复发是一个较为复杂的过程，脱落肿瘤细胞成功形成新瘤体必须具备相应条件［35］。由于部分患者术后复发源于术中肿瘤细胞脱落种植，所以对于患者术后肿瘤复发扩散的观察比较一定程度上反映了术中肿瘤脱落细胞种植播散有无可能。本研究平均随访时间39.9 个月，两组患者LRFS 和NRFS 以及DMFS 差异均无统计学意义（均P＞0.05），提示两组患者肿瘤复发或者扩散方面比较无明显差异，经肛门取标本的腹腔镜结直肠癌手术并未增加患者术后复发扩散风险。因此，在手术中坚持恶性肿瘤的无瘤化原则和根治性原则非常重要。

综上，虽然结直肠癌腹腔镜手术操作过程中，可以引起腹腔内细菌污染，也会出现肿瘤细胞脱落于腹腔和肠腔，但应用NOSE 技术的腹腔镜结直肠癌手术与传统腹腔镜结直肠癌手术比较，手术的无菌化和无瘤化安全程度无明显差异。

本研究仍然有一些不足之处。首先，研究不是多中心的，且样本数量有限。其次，采用普通细胞学检查灌洗液中游离脱落细胞，其敏感度不如RT-PCR 等方法高。再有，在标本取出过程中，部分患者需要先把网膜组织和结肠分离，这在一定程度上破坏了标本的完整性。这些均需要在后续的研究中加以完善，以便得出进一步的结论。