卵泡素样3基因在结肠癌组织中的表达及其与预后的关系

郭涛 辛振 王富豪

淮北矿工总医院胃肠外科（安徽淮北 235000）

结肠癌是全球第三大常见癌症［1-2］。虽然结肠癌的治疗已经取得了很大的进展，但是结肠癌患者的高复发率仍然是临床实践中的主要问题［3-4］。有效抑制结肠癌细胞转移的方法有限，对于远处转移的患者没有令人满意的治疗方法。大量的研究对结肠癌复发的机制进行了研究，这是解决临床问题的基石。

卵泡素样3（FSTL3，也称FSRP 或FLRG）是FSTL 家族的成员。FSTL3 是一种新的细胞因子，可调节胰岛素敏感性和抵消激活素或肌生成抑制素信号。最近的研究表明，FSTL3 参与调节葡萄糖和脂肪稳态、睾丸老化和睾丸大小［5］、骨骼重塑、骨关节炎、非小细胞肺癌［6］和其他生理过程或疾病。此外，还发现FSTL3 可以调节肿瘤的进展，例如，FSTL3 在侵袭性乳腺癌中过表达，通过拮抗内源性激活物促进肿瘤细胞的增殖［7］。然而，其在结肠癌中的表达和生物学功能尚不清楚。本研究前期通过分析TCGA 数据库中FSTL3 的结肠癌表达情况，发现FSTL3 是结肠癌的潜在治疗基因和诊断靶点。进一步通过临床病例数据分析其表达及预后，并通过基础实验验证FSTL3 在结肠癌中起到重要的作用。

1 资料与方法

1.1 数据库分析本研究通过TCGA 数据库下载结肠癌COAD 项目中level 3 HTSeq-FPKM 格式的RNAseq数据。将下载的521例结肠癌数据利用perl软件和R 语言软件整合，将患者按表达量中位数分为高表达组和低表达组进行分析和绘图，并利用数据进行结肠癌预后比较及诊断ROC 曲线绘制。

1.2 一般资料选取淮北矿工总医院自2015 年1月至2020 年12 月在外科手术的结肠癌组织蜡块90 例及其配对的癌旁组织。所有患者术前均未接受化疗、放疗、内分泌治疗及靶向治疗等辅助治疗，并于术前均有明确诊断及术后再次诊断为结肠癌。患者均签署知情同意书，研究方案经蚌埠医学院第一附属医院伦理委员会批准。

1.3 细胞培养和主要试剂结肠癌细胞SW620细胞购自中科院细胞研究所。DMEM 培养基、胰蛋白酶购自美国Hyclone 公司，胎牛血清（FBS）购自浙江天杭生物科技股份有限公司，FSTL3 过表达质粒及siRNA 由上海吉玛公司设计合成，Lipofectamin2000 于Thermo Scientific 公司购买。一抗（FSTL3、GAPDH）均购买于Abcam 公司，二抗购于武汉三鹰生物科技有限公司，Western blot 试剂盒及BCA 蛋白浓度测量试剂盒购自碧云天生物技术公司，四甲基偶氮唑盐（MTT）购自Biofroxx 公司。Transwell 小室及六孔板购自NEST 公司。

1.4 免疫组化检测FSTL3 蛋白将结肠癌组织蜡块90 例及其配对的癌旁组织，进行切片制备、脱腊、复水后对组织进行抗原修复，然后进行免疫反应，滴加一抗（1∶200），4 ℃冰箱孵育过夜。加二抗（1∶500），室温孵育1 h。DAB 化学染色，苏木素复染。酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.5 免疫组化结果判断采用二次计分法：每例标本随机计数5 个高倍视野（× 400），计数每个高倍视野中阳性细胞所占百分比。阳性染色结果判断：胞浆中的染色面积和棕黄色颗粒决定。染色强度标准如下［8］：以基本色度标准，0 分无色，1 分淡黄色，2 分棕黄色，3 分棕褐色。再将阳性细胞所占百分比计分，0 分为阴性，1 分为阳性细胞＜10%，2分为11%～50%，3 分为51%～75%，4 分为＞75%。用染色强度得分和细胞数得分的乘积作为判断表达结果，若积分0～4 分为阴性，4～12 分为阳性。因此，本研究将LYAR 阴性表达患者归为低表达组，阳性表达归为高表达组。免疫组化结果由两名以上高年资病理医师同时读片评定。

1.6 细胞转染取对数生长期细胞，于转染前24 h将细胞以3.0 × 104个/孔接种于6 孔板；转染时按照脂质体Lipofectamine TM2000 转染试剂说明书，SW620 细胞分别转染过表达质粒，记作FSTL3、NC及小干扰RNA，记作si-FSTL3、si-NC（细胞转染阴性对照NC），转染时加入相应试剂并混合均匀，将细胞培养基换为无血清培养基，5% CO2、37 ℃条件培养箱培养6 h 后更换新鲜培养基，然后进行后续实验。实验分组：NC 组、FSTL3 组、si-NC 组、si-FSTL3 组。siRNAi-FSTL3 序列为5′-GGAACAAGATCAACCTCCTCGGCTT-3′。

1.7 MTT 法检测待检测细胞用胰蛋白酶消化，以5×103个/mL 细胞悬液，每孔200 μL，加入96 孔板中，DMEM 培养基培养，细胞贴壁后，分别以24、48、72 h 加入MTT 溶液20 μL 混匀，继续孵育4 h；每孔加DMSO 150 μL，培养30 min；酶标仪检测490 nm处的吸光值（OD值），计算细胞增殖抑制率，抑制率=（1-实验组OD值）/对照组OD值×100%。

1.8 克隆形成实验转染24 h 后收集细胞，进行细胞计数后，将500 个细胞接种于6 孔板内，在5%CO2、37 ℃条件培养箱培养2 周后，弃去培养基，加入4%多聚甲醛，室温固定20 min，结晶紫染色10 min 后，拍照。

1.9 Transwell 检测细胞迁移能力无需铺基质胶外分别取对数生长期的si-NC 组、si-FSTL3 组、NC 组、FSTL3 组的SW620 细胞，每组设3 个复孔，消化离心后，用无血清培养基重悬于小室中。于37 ℃、5%CO2饱和湿度下培养24 h；取出小室；PBS清洗2 次，4%多聚甲醛固定15 min，用结晶紫染液室温下染色10 min；PBS 漂去多余染料，在200×视野下观察透膜细胞数。计数并求平均值，所有实验重复3 次。

1.10 Western Blot 检测转染48 h 的细胞加入预冷的RIPA 裂解液提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度；加入蛋白上样缓冲液，调整蛋白为相同浓度，95 ℃煮沸5 min 使蛋白变性；10%SDS-PAGE 电泳分离蛋白，分离后的蛋白转移至PVDF 膜，5%脱脂奶封闭2 h；一抗（FSTL3、GAPDH）按1∶1 000 稀释，4 ℃摇床孵育过夜，二抗1∶5 000 稀释，摇床孵育2 h；ECL 发光试剂，暗室曝光拍照，以Image J 软件分析目的蛋白，GAPDH 为内参计算蛋白的灰度值，以其比值为蛋白的相对表达水平。

1.11 统计学方法采用SPSS 21.0 软件进行统计学分析，两组间比较用配对t检验，率的比较采用χ2检验，采用受试者工作曲线（ROC）比较诊断效能，单因素及多因素分析采用Cox 比例风险回归模型，生存分析采用Kaplan-Meier 法计算。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA数据库中FSTl3在结肠癌中的表达及预后情况在TCGA 数据库中，FSTL3 基因在非配对组中，相比较于正常组织，在癌组织中的表达量明显上升（图1A）。在配对组中，相较于癌旁组织，癌组织中FSTL3 表达明显较高（图1B）。以FSTL3的表达量作为诊断结肠癌的指标绘制ROC，曲线下面积0.776（95%CI：0.707～0.846）。以表达量2.186为诊断节点，灵敏度0.749，特异度0.683，约登指数1.432，阳性预测值0.965，阴性预测值0.189（图1C）。对FSTL3 在结肠癌组织的表达进行K-M 生存分析显示，高表达组的生存率显著低于低表达组（P＜0.008，图1D）。

图1 TCGA 数据库中FSTL3 在结肠癌中的表达及预后情况Fig.1 The expression and prognosis of FSTL3 in colon cancer in the TCGA database

2.2 FSTL3 蛋白表达与结肠癌临床病理特征的相关性FSTL3在结肠癌中的表达与年龄（P=0.049）、TNM 分期（P=0.033）、浸润深度（P=0.06）、远处转移（P=0.001）有关，而与性别（P=0.386）、淋巴转移（P=0.215）、分化程度（P=0.565）无关。见表1。

表1 FSTL3 表达与患者临床病理因素的关系Tab.1 Relationship between FSTL3 expression and clinicopathological factors in patients例

2.3 免疫组化检测FSTL3 蛋白表达在90 例结肠癌组织蜡块和与其相匹配的癌旁正常组织中，FSTL3 蛋白在癌组织中阳性表达明显高于癌旁正常组织（P＜0.001），见表2。FSTL3 阳性反应物定位于细胞胞浆中，见图2。

图2 免疫组化检测FSTL3 蛋白在结肠癌组织的表达（×200）Fig.2 The expression of FSTL3 protein in Colon cancer tissues was detected by immunohistochemistry（×200）

2.4 FSTL3 蛋白达与结肠癌患者预后的关系本课题组收集90 例患者资料，随访时间60 个月，死亡66 例，总体生存率26.7%。对FSTL3 表达情况进行K-M 分析，发现结肠癌组织中，FSTL3 高表达患者生存率显著低于低表达患者。见图3。

图3 结肠癌患者FSTL3 高表达组与FSTL3 低表达组5 年生存率比较Fig.3 The 5 years survival rate in the FSTL3 overexpression group was significantly lower than that in the FSTL3 low expression group

2.5 结肠癌预后单因素及多因素分析采用Cox比例风险模型分析预后，单因素结果显示，FSTL3高表达，年龄，浸润深度，远处转移是结肠癌的预后因素。多因素结果分析显示，FSTL3 过表达、浸润深度是结肠癌的预后因素。见表2。

表2 FSTL3 表达以及临床特征对结肠癌患者生存率的影响Tab.2 The effect of FSTL3 expression and clinical characteristics on the survival rate of colon cancer patients

2.6 FSTL3沉默后的表达水平Western Blot 检测显示，与si-NC 组比较，si-FSTL3 组SW620 细胞中FSTL3 的蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），见图4A。与NC 组比较，FSTL3 组SW620 细胞中FSTL3的蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），见图4B。

图4 转染48 h 后结肠癌细胞SW620 中的FSTL3 表达水平Fig.4 The expression level of FSTL3 in colon cancer cell SW620 48 h after transfection

2.7 FSTL3 基因对结肠癌细胞增殖的影响克隆形成实验检测显示，转染si-FSTL3 后的SW620 细胞形成的细胞集落数目少于对照组（P＜0.05）。同样的，过表达FSTL3 后，FSTL3 组SW620 细胞形成的细胞集落数目明显多于NC 组（P＜0.05），见图5A。MTT 检测显示，与si-NC 组比较，si-FSTL3组结肠癌细胞株SW620 细胞24、48、72 h 增殖率显著下降（P＜0.05）。同样的，MTT 检测显示，与NC组比较，FSTL3 组SW620 细胞24、48、72 h 增殖率显著上升（P＜0.05），见图5B。

图5 FSTL3 对结肠癌细胞增殖的影响Fig.5 The effect of FSTL3 on the proliferation of colon cancercells

2.8 FSTL3 基因对结肠癌细胞迁移的影响Transwell 实验显示，与si-NC 组比较，si-FSTL3 组结肠癌细胞株SW620 细胞的迁移细胞数目显著降低（P＜0.05）。过表达FSTL3后，与NC组比较，FSTL3组SW620 细胞的迁移细胞数目显著增高（P＜0.05），见图6。

图6 FSTL3 对结肠癌细胞迁移的影响Fig.6 The effect of FSTL3 on the migration of colon cancer cells

3 讨论

结肠癌是最常见的消化道癌症之一，死亡率较高，给全球带来了巨大的健康负担。然而，结肠癌的发病机制尚不清楚。研究表明，越来越多的分子被发现参与了该疾病的发生发展。既往研究发现FSTL 家族成员在肿瘤中表达异常，并参与肿瘤发生和进展［9-11］。如FSTL1 在非小细胞肺癌中表达下调，过表达可显著抑制细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡［12］；而FSTL1 在肝癌中表达上调，下调其表达可促进细胞凋亡，抑制细胞增殖［13］。有研究报道FSTL5 在肝细胞癌中表达下调，过表达可抑制癌细胞存活［14］。FSTL3 作为FSTL 家族的一员，在肿瘤中也存在异常表达的物质。例如，FSTL3 可以作为乳腺癌和肝细胞癌的癌症生物标志物。FSTL3 在乳腺癌中表达上调，过表达可促进肿瘤的发生进展。这些结果表明，FSTL3 作为一种致癌基因参与了癌症的发生发展。

本研究中，首先通过分析TCGA 数据库中的结肠癌数据，发现FSTL3 不论是在配对样本还是非配对样本中，表达水平都明显上升。以FSTL3 的表达量作为诊断结肠癌的指标绘制ROC，曲线下面积为0.776，以FSTL3 作为诊断结肠癌的指标，具有一定的准确性。并且FSTL3 高表达患者生存率明显低于FSTL3 低表达患者，这提示FSTL3 可能是结肠癌的生物学标志物。随后，收集了90 例结肠癌病例，通过免疫组化检测了FSTL3 在结肠癌中的表达水平，验证了TCGA 数据库的结果。同时，发现FSTL3 在结肠癌中的表达与年龄（P=0.049）、TNM 分期（P=0.033）、浸润深度（P=0.06）、远处转移（P=0.001）有关，而与性别（P=0.386）、淋巴转移（P=0.215）、分化程度（P=0.565）无关。通过单因素分析显示，FSTL3 高表达、年龄、浸润深度、远处转移是结肠癌的预后因素。多因素结果分析显示，FSTL3 过表达、浸润深度是结肠癌的预后因素。此外，通过转染结肠癌细胞SW620 细胞株，得到FSTL3 过表达及沉默细胞株。通过克隆形成实验及MTT 实验，发现过表达FSTL3 相比与对照组，明显促进结肠癌细胞增殖。相反，敲低FSTL3 表达，结肠癌细胞增殖受到明显抑制。通过Transwell 实验，发现过表达FSTL3，结肠癌细胞迁移明显增长。相反，敲低FSTL3，结肠癌细胞迁移明显受到抑制。这些结果都提示FSTL3 可能是一种原癌基因。相较于在前期的研究报道中FSTL3 在非小细胞肺癌及肝癌中，表达异常，本课题组首次发现FSTL3 在结肠癌中表达上调，FSTL3 的表达量与患者的生存时间有关。同时，进一步进行体外实验，发现调控FSTL3 的表达量，可以调控结肠癌细胞的增殖、侵袭及迁移。这些发现为结肠癌的治疗提供了新的靶基因。因此可以判断，检测结肠癌组织中FSTL3 蛋白量有助于判断肿瘤的恶性程度和进展状态。然而，本研究没有对FSTL3 在结肠癌中的分子机制进行深入研究。下一步将深入研究FSTL3 在结肠癌中作用机制。

综上所述，FSTL3 在结肠癌组织中高度表达，并且FSTL3 在结肠癌的预后和进展中具有重要意义。此外，敲低其表达可以明显抑制结肠癌细胞的增殖、迁移，而过表达FSTL3 则有促癌作用。FSTL3 作为一种致癌基因参与了结肠癌的发生和发展。