维生素D 受体基因多态性与妊娠期糖尿病的关系

陈慧敏 萧敏华 孙静 吴锦晖 罗红凤 刘喜红

广州医科大学广州市妇女儿童医疗中心（广州 510623）

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是指孕期首次发现的任何程度的糖耐量异常［1-2］。GDM 已成为全球主要的公共卫生问题，我国GDM 的发病率高达11.9%～18.9%［3-4］，并逐年上升。GDM严重危害母婴健康，增加了母婴围产期并发症的发生风险［5］，也与母亲及后代的2 型糖尿病等代谢性疾病密切相关［6］。

VDR 基因多态性的国内外研究在2 型糖尿病患者的人群研究较多，结果尚不一致［7-9］，而关于GDM 人群的文献报道较少，结论存在争议，且存在样本量偏少，忽视控制混杂因素等问题［10-11］。基因多态性还存在国家、地域的差异性［12］，因此更有必要在中国GDM 人群中进一步开展研究。为深入探索GDM 是否与VDR 基因多态性有关系，本研究分析了中国人群VDR 基因（rs2228570 G ＞A，rs739837 G＞T）的多态性与GDM 的关系，探讨GDM的遗传易感因素及可能的发病机制，对妊娠糖尿病的预测、从医学营养的角度预防和治疗都具有重要的意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象本研究是一项基于中国人群的病例-对照研究。2019 年6-11 月，在广州市妇女儿童医疗中心产科门诊建档的孕妇中，招募符合标准的研究对象。纳入标准：年龄22～40 岁，单胎，孕龄24～28 周，彼此为无血缘关系的个体，自愿参与本研究。排除标准：孕前原有的糖尿病、多囊卵巢综合征、高血压等基础疾病及其他影响血糖调节的疾病，多胎妊娠，不能配合研究实施者。按我国的GDM 诊断标准［1］及2019 年美国ADA 糖尿病诊断标准，孕24～28 周时口服75 g 葡萄糖耐量试验（OGTT）结果任何一点达到或超过临界值（空腹5.1 mmol/L，1 h 10.0 mmol/L，2 h 8.5 mmol/L）即诊断为GDM。由Quanto1.2.4 软件根据等位基因频率及患病率等估算样本量，并保证对照组样本量大于病例组。筛选符合诊断标准及纳入标准的GDM孕妇555 例为病例组，在同一门诊选择与检测日期、孕周和孕产次相匹配的646 例正常孕妇为对照组。本研究获得广州市妇女儿童医疗中心伦理委员会的批准（第114A01 号），并与孕妇签署了科学研究知情同意书。通过问卷调查和半结构式访谈收集一般资料和病史。

1.2 病例资料（1）孕前BMI=孕前体质量（kg）/身高（m）2，孕前体质量由孕妇提供，身高为招募时体格测量值。（2）孕晚期糖化血红蛋白（HbA1c）是指孕28～32 周的血液检验数据。（3）糖尿病或高血压家族史定义为一级亲属（父，母，兄弟姐妹）或二级亲属（祖父母，外祖父母，父母的同胞）至少1 人患糖尿病或高血压。（4）不良孕产史包括不孕不育、自然流产、死胎、死产、生育畸形或智力低下儿等。

1.3 研究方法

1.3.1 候选基因位点的选择结合常用的NCBIdbSNP（single nucleotide polymorphism，SNP）数据库，选择的SNP 位点主要位于5′UTR 非编码区（5′-untranslatedregion）、3′UTR 和外显子等基因功能区域，可以导致与转录起始因子结合能力改变、microRNA 结合能力改变或引起氨基酸改变等，从而导致不同的生理功能。根据千人基因组数据库选择位点在中国正常人群中最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）＞0.05 及低连锁不平衡（R2＜0.8）。综合考虑以上因素最终选择了维生素D 受体基因的2 个SNP 位点：位于基因5′端第2 外显子起始密码子的突变rs2228570 和3′UTR 的rs739837。

1.3.2 基因多态性分析所有研究对象留取EDTA抗凝全血2 mL，用于提取DNA。利用DNA 抽提试剂盒（MaGen 美基生物公司）按标准操作流程提取基因组DNA。将合格DNA 样品稀释至10 ng/μL，装入96 孔板中。引物和探针由美国应用生物系统（ABI）公司合成，采用Taqman SNP 基因分型试剂盒，应用ABI Quant StudioTM实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）系统对这两个VDR 的SNP 位点进行基因分型。PCR 的反应条件设置为：95 ℃活化10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，共45 个循环。

1.4 统计学方法采用SPSS 19.0 进行统计分析，正态分布的计量资料用均数±标准差表示，比较分析采用t检验。计数资料用例数和百分数描述，两组间比较采用χ2检验。对基因多态性数据进行Hardy-Weinberg 平衡检验（HWE），其中显性遗传模型（aa+Aa/AA）、隐性遗传模型（aa/Aa+AA），a为突变等位基因，A 为野生等位基因。多因素分析采用非条件logistic 回归。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料病例组和对照组孕妇的年龄、孕次和产次的比较差异无统计学意义（P＞0.05）。GDM 患者的孕前BMI、OGTT 血糖值、孕晚期糖化血红蛋白（HbA1c）、糖尿病家族史、高血压病家族史和不良孕产史发生率显著高于正常孕妇对照组（P＜0.05），见表1。

表1 病例和对照组一般资料的比较Tab.1 Comparison of general data between the case and control group

表1 病例和对照组一般资料的比较Tab.1 Comparison of general data between the case and control group

2.2 维生素D受体基因多态性与GDM的遗传易感性关系对照组符合HWE 平衡（rs2228570 G ＞A，P=0.692；rs739837，G ＞TP=0.236），证实本研究的资料具有群体代表性。选择的两个SNPs 位点的基因型分布、等位基因频率和不同遗传模型分析见表2，rs2228570 位点的基因型和等位基因频率在病例和对照组间差异有统计学意义（P＜0.05），在显性模型下表现出与GDM关联（P＜0.05）；rs739837 位点的多态性分析在两组间的差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 VDR 基因的SNPs 位点多态性和GDM 遗传易感性的关系Tab.2 Association between VDR gene SNPs and genetic susceptibility of GDM 例（%）

2.3 VDR 基因多态性与GDM 发生的多因素分析以是否GDM 为因变量，年龄、孕前BMI、糖尿病家族史、不良孕产史、高血压家族史、rs2228570位点多态性为自变量进行logistic 回归分析，自变量赋值见表3。结果显示：年龄、孕前BMI、不良孕产史、高血压家族史和rs739837 位点多态性与GDM 无关（均P＞0.05），rs2228570 位点多态性和糖尿病家族史是GDM 的独立危险因素（P＜0.05），见表4。

表3 自变量赋值表Tab.3 Independent variable assignment table

表4 GDM 影响因素的logistic 回归分析Tab.4 Logistic regression analysis of influencing factors for GDM

3 讨论

维生素D 受体为亲核蛋白，作为配体依赖性转录因子，是核激素受体家族的一员。人类VDR基因位于第12 染色体长臂q13～14 区，整个基因组由9 个外显子和8 个内含子组成。rs2228570 位点，也称为FokI 限制性内切酶的酶切位点，位于VDR 蛋白翻译的起始位点，是目前唯一已知的可以改变蛋白结构的VDR 的单核苷酸多态性［13］，产生424 或427 个氨基酸两种不同的蛋白质，在胰岛素的代谢途径中发挥作用［14］。rs739837 位于3′UTR 非编码区，其变异不影响氨基酸序列，不太可能影响VDR 本身的功能，但它可能位于能够调节VDR 表达的microRNA 的结合位点，可调节基因的表达，尤其对mRNA 的稳定性有调控作用。

目前在GDM 人群中关于rs2228570（FokⅠ）位点的研究结果存在矛盾。SIQUEIRA 等［10］报道了巴西人群GDM 与VDR 受体基因FokⅠ多态性没有关系。ASLANI 等［15］在伊朗人群中的研究发现rs2228570 多态性与GDM 的风险增加有关联。APAYDIN 等［11］在土耳其人群发现FokⅠ多态性与GDM 的发生有关系，其变异可能导致GDM 患者胰岛素抵抗受损和代谢紊乱。本研究样本量更充足，结果支持rs2228570 位点多态性与GDM 的发病有关系，可能在GDM 的发病机制中起潜在作用这一论点。与对照组比较，GDM 组等位基因A 的频率更高。从GDM 发病风险来看，A 等位基因携带者是G 等位基因携带者的1.72 倍，GA 基因型携带者是GG 基因型的2.80 倍，AA 基因型携带者是GG基因型的3.98 倍。在显性模型下表现出与GDM 有关联，至少携带1 个等位基因A 的个体是非携带者患病风险的3.07 倍。结果提示AA 基因型为易感基因型，而A 等位基因为易感基因。活性维生素D需通过与VDR 结合而显示其细胞活性，调节胰腺β 细胞的胰岛素分泌［16］。A 等位基因编码较长的VDR 蛋白质［17］，转录的活性较弱，从而造成生理功能的下降，可能导致胰岛素合成和分泌缺陷，在GDM 发病机制中起一定作用。总之，本研究表明rs2228570 位点多态性是GDM 的独立危险因素，今后通过VDR 的基因分型可以发现GDM 易感人群，从而提供有针对性的维生素D 补充建议。

研究表明rs739837 与中国人群2 型糖尿病及其脂质代谢有关系［18-19］，该位点变异增加了2 型糖尿病的患病风险。但在妊娠期人群中没有观察到病例和对照之间rs739837基因型频率的显著差异。虽然GDM 和2 型糖尿病可能具有相似的风险因素和遗传易感性［20］，但本研究的结果提示rs739837 与GDM 没有显著关联，与既往在2 型糖尿病人群的结果不一致，可能的原因包括：（1）rs739837 的变异并不影响VDR 基因的功能，在GDM 发病机制中所起的作用较弱。（2）GDM 发生在育龄妇女，妊娠后受胎盘分泌的激素影响加重了胰岛素抵抗［21］，在发病年龄、性别和妊娠生理特点等方面与2 型糖尿病有明显的区别。（3）不同研究群体的结果差异可能与地域、环境、样本量和实验方法等因素有关。

本研究的创新点在于：在中国人群中发现了rs2228570 位点与GDM 的关联，为寻找中国GDM孕妇的易感基因提供了新的理论依据，并探讨了VDR 基因多态性在GDM 发病机制中可能的作用。虽然研究设计合理，但也存在一些局限性：首先，没有检测血清维生素D 水平，缺乏相关的分析。其次，选取了2 个位于功能区的SNPs，数目较少，今后可增加位点数目以获得更为全面的结果。最后，研究对象来自同一家医疗机构，缺乏对地域、环境及生活方式等因素的分析，今后可开展多中心、大样本、不同地区人群的关联研究以及功能学研究进一步证实本实验结果。

综上所述，中国人群中VDR 基因rs2228570 位点多态性与GDM 的发生有关系，可能是GDM 的易感基因之一。本研究结果可为鉴定GDM 早期风险预测的生物标志物以及发病机制的探索提供科学依据，为GDM 的预防和治疗提供新的思路。